高碘酸氧化和Smith降解!!!.doc

高碘酸氧化和Smith降解原理：高碘酸氧化和Smith降解 高碘酸可选择性断裂糖分子中的邻二羟基或邻三羟基处,生成相应的多糖醛,甲醛或甲酸.反应定量进行,每开裂1个CC键消耗1分子高碘酸.通过测定高碘酸的消耗量及甲酸的释放量,可以判断糖苷键的位置,直链多糖的聚合度,分支多糖的分支数等.Smith降解是将高碘酸氧化产物还原后酸水解,再鉴定水解产物,从而推断糖苷键的位置与分支点等.以葡萄糖为例,以12或1 4位键合的糖基经高碘酸氧化,平均每个糖基消耗1分子高碘酸,且无甲酸释放;13位键合的糖基不被高碘酸氧化;16位键合的糖基或非还原末端糖基经高碘酸氧化,消耗2分子高碘酸同时释放1分子甲酸.准备物品：容量瓶（25ml * 2，50ml * 2；茶色为好）、锡纸、碱式滴定管、定量滤纸；高碘酸钠、乙二醇、溴甲酚(红)紫指示剂、0.005N NaOH(由0.1N NaOH稀释20倍制得，使用前用邻苯二甲酸氢钾标定)、NaBH4或KBH4、50% HAc、1M H2SO4、BaCO3、乙醇。实验步骤：（1）准确配置30mM NaIO4 50ml （320.8mg NaIO4，定容至50ml），用锡纸包好避光，取0.1ml稀释至25ml，223nm处测定吸光值大于0.6方可使用。（注：此溶液必须现用现配。） （2）准确称取糖样50mg（记录下准确质量），用少量水溶解于50ml容量瓶中，然后加入30 mM NaIO4 25ml，蒸馏水定容，使NaIO4 终浓度为15mM。用锡纸包好避光，放置在低温暗处反应，间隔时间(0、6、12、24、36、48、60小时)取样0.1ml，用蒸馏水稀释250倍，以蒸馏水作空白对照，在223nm波长处测光密度值，直到光密度值恒定为止。（3）同时将剩余的30mM NaIO4 稀释为15mM，与反应样品同样放置作为对照，待反应结束时取出0.1ml，稀释250倍后，用蒸馏水按不同比例稀释，每浓度三个重复，测定223nm处的光密度值，以OD值为纵坐标，NaIO4浓度为横坐标，制作标准曲线。NaIO4浓度（Mm）03691215蒸馏水（ml）543210NaIO4溶液（ml）012345（4）通过查标准曲线，计算出高碘酸的消耗量。消耗高碘酸的量（mmol）=(反应前高碘酸浓度-反应后高碘酸浓度)*反应体积（5）取2ml上述氧化液，加1滴溴甲酚(红)紫作指示剂，用0.005N NaOH溶液滴定，计算得甲酸生成量。甲酸生成量（mmol）=（NaOH的准确浓度*滴定用的体积/2ml）*反应体积（6） 加乙二醇终止高碘酸氧化反应。流水及蒸馏水各透析24小时。浓缩至10ml，加入KBH4 70mg 还原过夜。用50% 乙酸中和至pH为67，流水及蒸馏水各透析24小时。取1/3干燥后做完全酸水解和GC分析，剩余部分进行Smith降解。（2）加入等体积的1M H2SO4，25水解40小时，BaCO3 中和至pH为6，用定量滤纸过滤，滤液用蒸馏水透析8小时，袋外部分干燥做GC分析，滤液再用流水蒸馏水各透析24小时，袋内部分水浴浓缩到适当体积，加乙醇醇析，离心，上清及沉淀部分干燥后分别做完全酸水解和GC分析。 高碘酸氧化、Smith降解实验原理：高碘酸氧化和Smith降解： 高碘酸可选择性断裂糖分子中的邻二羟基或邻三羟基处,生成相应的多糖醛,甲醛或甲酸.反应定量进行,每开裂1个CC键消耗1分子高碘酸.通过测定高碘酸的消耗量及甲酸的释放量,可以判断糖苷键的位置,直链多糖的聚合度,分支多糖的分支数等.Smith降解是将高碘酸氧化产物还原后酸水解,再鉴定水解产物,从而推断糖苷键的位置与分支点等.以葡萄糖为例,以12或1 4位键合的糖基经高碘酸氧化,平均每个糖基消耗1分子高碘酸,且无甲酸释放;13位键合的糖基不被高碘酸氧化;16位键合的糖基或非还原末端糖基经高碘酸氧化,消耗2分子高碘酸同时释放1分子甲酸.。高碘酸氧化是一种选择性的氧化反应，它只能作用于多糖分子中连二羟基或连三羟基处。当连二羟基的C-C键被氧化断开后，产生相应的醛；当连三羟基的C-C键被氧化断开后，产生甲酸及相应的醛。此反应定量进行，每断开1molC-C键，消耗1mol高碘酸，每生成1 mol 甲酸对应消耗2mol高碘酸。因此，通过测定高碘酸消耗量及甲酸生成量，便可以判断糖苷键的位置、直链多糖的聚合度及支链多糖的分支数目等。高碘酸氧化产物经硼氢化钾还原，得到的多糖醇用稀酸在温和条件下水解，可发生特异性降解，称为Smith降解。Smith降解的特点是只打断被高碘酸破坏的糖苷键，而未被高碘酸氧化的糖残基仍连在糖链上。这样，多糖醇经Smith降解，就可以得到小分子的多元醇和未被破坏的多糖或寡糖片断，对这些产物进行分析，便可以推断出糖苷键的键型及其位置。下面以各种键型连接的葡聚糖为例，反应式如下：以12或12,6位糖苷键连接的葡聚糖反应式： 以1或16位糖苷键连接的葡聚糖反应式： 以14或14,6位糖苷键连接的葡聚糖反应式： 以13、13,6、12,3、12,4、13,4、12,3,4位糖苷键连接的葡聚糖反应式：由此可见：（1）1mol 1或16位糖苷键连接的葡聚糖被高碘酸氧化时消耗2 mol高碘酸，生成1 mol甲酸；（2）1mol 12或12,6、14、14,6位糖苷键连接的葡聚糖被高碘酸氧化时只消耗高碘酸，不生成甲