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人类遗传病实验讲义实验一 真核细胞DNA的制备与定量制备基因组DNA是进行基因结构和功能研究以及基因诊断的重要步骤，通常要求得到的片段长度不小于100200kb。在DNA提取过程中应尽量避免使DNA断裂和降解的各种因素，以保证DNA的完整性，为后续的实验打下基础。一般真核细胞基因组DNA有107-9bp，可以从新鲜组织、培养细胞或低温冻存的组织细胞中提取，以前常是采用在EDTA以及SDS等试剂存在下用蛋白酶K消化细胞，随后用酚抽提而实现的，现在已开发出专门用于提取基因组DNA的试剂盒。通过这一方法获得的DNA不仅酶切后可用于Southern分析，还可用于PCR的模板、文库构建等实验。根据材料来源不同，采取不同的材料处理方法，而后的DNA提取方法大体类似，但都应考虑以下两个原则：（1）防止和抑制DNase对DNA的降解：（2）尽量减少对溶液中DNA的机械剪切破坏。实验试剂及仪器1 DNA提取试剂盒（BBI），内含TE水，细胞裂解液，沉淀液，1.2M的NaCl，蛋白酶K，RNase A2 预冷的无水乙醇，70%乙醇，氯仿3 超声波细胞粉碎仪、高速冷冻离心机、恒温水浴锅实验步骤1取100mg小鼠脾脏组织，加入200l的TE，用超声波细胞粉碎仪充分匀浆。2加入400l的细胞裂解液，充分混匀，再加入6l的蛋白酶K，55孵育10分钟，中间偶尔混匀。3加入600l的氯仿，轻柔混匀，高速离心（10000rpm）2分钟，此时样品应该分为三相，而基因组DNA在最上面一相中。如果未能分成以上各相，那就是样品与氯仿之间未能混合均匀。4将500l上清移入一新的1.5ml离心管中，加入500l的沉淀液，混合均匀，室温放置2分钟，高速离心2分钟。5弃上清，将沉淀重溶于100l 1.2mol/l的NaCl中，轻弹，直至沉淀完全溶解，再加入3l的RNase A，37孵育10分钟。6加入300l预冷的无水乙醇，混匀，并在-20放置10分钟。高速离心5分钟，弃上清，用70%的乙醇洗涤沉淀，离心弃上清，空气中干燥10分钟。7将沉淀溶于100l的TE中，37孵育2小时。DNA定量和电泳检测1. DNA定量DNA在260nm处有最大的吸收峰，蛋白质在280nm处有最大的吸收峰，盐和小分子则集中在230nm处。因此，可以用260nm波长进行分光测定DNA浓度，OD值为1相当于大约50g/ml双链DNA。如用1光径，用H2O稀释DNA样品n倍并以H2O为空白对照，根据此时读出的OD260即可计算出样品稀释前的浓度：DNA（/ml）=50*OD260读数*稀释倍数/1000。DNA纯品的OD260/OD280为1.8，故根据OD260/OD280的值可以估计DNA的纯度。若比值较高说明含有RNA，比值较低说明有残余蛋白质存在。OD230/OD260的比值应在0.4-0.5之间，若比值较高说明有残余的盐存在。2. 电泳检测：取1g基因组DNA用行0.8琼脂糖凝胶上电泳，检测DNA的完整性，或多个样品的浓度是否相同。电泳结束后在点样孔附近应有单一的高分子量条带。注意事项：1所有用品均需要高温高压，以灭活残余的DNA酶。2所有试剂均用高压灭菌双蒸水配置。3用大口滴管或吸头操作，以尽量减少打断DNA的可能性。4用上述方法提取的DNA纯度可以满足一般实验（如Southern杂交、PCR等）目的。如要求更高，可参考有关资料进行DNA纯化。作业与思考1如何防止DNA的降解？2蛋白酶K和RNase A的作用是什么？3如果DNA降解成小片段，电泳时会出现什么样的电泳图象？7实验二 PCR法检测微卫星位点多态性实验目的1、掌握PCR的原理，了解PCR技术的操作。2、了解微卫星位点的实际应用意义。实验原理PCR技术是在模板DNA、引物和四种脱氧核糖核苷酸存在下，依赖于DNA聚合酶的酶促合成反应。DNA聚合酶以单链DNA为模板，借助一小段双链DNA来启动合成，通过一个或两个人工合成的寡核苷酸引物与单链DNA模板中的一段互补序列结合，形成部分双链。在适宜的温度和环境下，DNA聚合酶将脱氧单核苷酸加到引物3-OH末端，并以此为起始点，沿模板53方向延伸，合成一条新的DNA互补链。PCR反应的基本成分包括：模板DNA(待扩增DNA)、引物、4种脱氧核苷酸(dNTPs)、DNA聚合酶和适宜的缓冲液。类似于DNA的天然复制过程，其特异性依赖于与靶序列两端互补的寡核苷酸引物。PCR由变性-退火-延伸三个基本反应步骤构成：模板DNA的高温变性：模板DNA经加热至93左右一定时间后，使模板DNA双链或经PCR扩增形成的双链DNA解离，使之成为单链，以便它与引物结合，为下轮反应作准备；模板DNA与引物的低温退火(复性)：模板DNA经加热变性成单链后，温度降至55左右，引物与模板DNA单链的互补序列配对结合；引物的适温延伸：DNA模板-引物结合物在TaqDNA聚合酶的作用下，以dNTP为反应原料，靶序列为模板，按碱基配对与半保留复制原理，合成一条新的与模板DNA 链互补的半保留复制链重复循环变性-退火-延伸三过程，就可获得更多的“半保留复制链”，而且这种新链又可成为下次循环的模板。每完成一个循环需24分钟，23小时就能将待扩目的基因扩增放大几百万倍。微卫星位点是第二代遗传标记，它在人群中具有多态性，呈现孟德尔式稳定遗传，并且与基因呈现连锁关系。因此可用于进行间接基因诊断、个体识别和亲子鉴定。实验试剂相关引物合成，PCR反应试剂（包括Mg2、10PCR Buffer、2mMdNTP、Taq酶），外周血DNA，1%琼脂糖凝胶（含EB），1TBE电泳缓冲液，凝胶成像仪，DNA标准带（DL-2000）实验步骤1、PCR反应体系：DNA：2l(1g/l)10PCR Buffer：2.5l2mM dNTP：2l引物：2l Mg2：1.5lTaqDNA聚合酶：0.2l水：14.8l总反应体积为25l。2、循环条件：预变性94度3分钟;循环:94度x30s，50度x30s，72度x30s，32个循环，总延伸：72度x5min。3、电泳检测：1%琼脂糖(含EB)在TBE中电泳，电压57v/cm，溴酚蓝泳至3cm处停止电泳，紫外观察。结果判断根据PCR电泳带与DNA标准带进行分析个体差异的判断。注意事项1、反应体系中各成分加样量需准确，且需混合均匀。2、EB为致畸、致癌变物质，注意防护。作业与思考1. 如果电泳过度会出现什么情况？2. PCR时如果漏加任一成分会出现什么情况？ 3. 除了微卫星位点还有哪些遗传标记？实验三 人类外周血染色体制备染色体是基因的载体，人二倍体细胞的一个染色体上约有34万个基因。染色体的数目或结构发生变化，必然导致其携带基因的增加或缺失，从而引起一系列临床症状。染色体检查已成为产前诊断及优生的重要手段。染色体技术有广泛的应用，本次实验主要介绍人类外周血染色体的制备。实验目的1. 学习外周血淋巴细胞悬浮培养的原理和方法2. 利用培养后进行分裂的细胞制备人类染色体标本实验原理外周血中的淋巴细胞几乎都是处在G0期或G1期，一般情况下是不分裂的。当在培养基中加入植物血凝素（phytohemagglutinin PHA）时，这种小淋巴细胞受到刺激后转化为淋巴母细胞，并开始进行有丝分裂。经过短期培养后，用秋水仙素处理就可获得大量中期分裂相的细胞，制片后可以清楚地对染色体进行观察。这种培养方法是Moorhead于1960年建立的。在人类遗传分析中普遍采用外周血培养的方法获取分裂的细胞，进而开展临床和遗传学的研究，这对于遗传疾病的检出以及遗传咨询等工作发挥了重要作用。PHA是从红肾豆（Phaseolus vulgaris）和深兰豆（Phaseolus communis）的盐提取液中得到的一种粘蛋白。在早期的实验中将它用于红细胞的凝聚反应，自从20世纪60年代发现它具有刺激细胞进行有丝分裂的作用以后便得到更为广泛的应用。在PHA作用下，人外周血淋巴细胞可被刺激转化为淋巴母细胞，进行有丝分裂。经实验测定其分裂高峰分别于培养后44-48小时和68-72小时。PHA有粘多糖、蛋白质两种重要成分。粘多糖促使有丝分裂，蛋白质起凝集作用。PHA激活的细胞数随其浓度而增加，但PHA浓度过高会引起凝集，一般用3040mg/100ml。培养基的成分对于细胞的分裂繁殖有重要的影响，当在培养基中加入体积分数1040的血清时能够维持细胞正常的代谢活动。同时，较多的血清还将更有效地控制培养基的pH值。实验表明：当人体外周血的培养温度为3637oC时，有丝分裂活性的高峰在6072h；若将培养温度严格控制在38oC时，有丝分裂的高峰可提前到48h；若培养温度高于39oC时，则导致细胞的死亡。秋水仙素（colchicine）可以抑制细胞纺锤体的形成，使处在分裂的细胞停留在中期。因此利用秋水仙素处理可以获得许多同步的中期分裂细胞，但是由于使用秋水仙素处理会引起染色体在一定程度上的浓缩，因此在处理时间和浓度上要合适。一般使用秋水仙素的浓度在0.10.2g/mL。徐道觉（T. C. Hsu）等于1952年发现在固定细胞之前使用低渗液进行处理，可以使细胞的核膜吸水膨胀而破裂，染色体分散开来，在显微镜下易于观察和统计，染色效果也明显提高。这种技术被广泛采用后，使人类染色体分析技术得到了发展。低渗液是指渗透压和离子强度均低于正常细胞生理条件的溶液。我们采用的是0.35%KCl，其优点有1）染色体轮廓清楚，可染色性强，染色时间短。 2）用于显带染色时能充分显示带型特点。 低渗处理为37oC，25分钟。低渗使红细胞破裂，淋巴细胞膨胀、肿大。固定液的重要特性是能迅速穿透细胞，将其固定并维持染色体结构的完整性，还要能够增强染色体的嗜碱性，达到优良染色效果。甲醇：冰醋酸=3：1（Carnoy固定液）实验用具及材料培养瓶、注射器、量筒、恒温水浴箱、离心机、移液器、离心管、滴管、试剂瓶、CO2培养箱、RPMI1640、小牛血清、植物血凝素（PHA）、NaHCO3、生理盐水、肝素、秋水仙素水溶液、氯化钾、甲醇、冰醋酸、4.0g/L酚红、链霉素、青霉素、实验步骤一、细胞培养1. 培养基的配制2. 采血：酒精棉球消毒皮肤，肘静脉采血0.30.5 ml。在10ml 培养基中滴入30-40滴全血，轻摇匀后置37oC恒温培养。3. 培养：时间为68小时。培养过程中，定期轻摇匀，使细胞充分接触培养基。4. 秋水仙素处理：终止培养前24小时，在培养基中加入秋水仙素2滴，使终浓度为0.07g/ml 。以上步骤需无菌操作。二、染色体制备1. 收集细胞：培养物转入离心管，1000rpm离心810分钟，弃上清。2. 低渗处理：向刻度离心管中加入预温37的低渗液8ml，用滴管混匀，置37恒温水浴中低渗25分钟。3. 预固定：低渗后加入0.5ml固定液，轻轻混匀，静置5min，800rpm离心810分钟。4. 一固定：弃上清，留约0.51ml，加入固定液8ml，轻轻混匀，静置10分钟，800rpm离心10分钟。 5. 二固定：弃上清，留约0.51ml，加入固定液6ml，轻轻混匀，静置10分钟，800rpm离心10分钟。6. 滴片：弃上清，留约0.5 1ml，混匀、滴片。滴片可使淋巴母细胞膜破裂，染色体分散开。滴片后需空气干燥。7. 染色：1:10 Giemsa染色510分钟，细水洗去多余染液，气干，镜检。注意事项1. 培养温度：370.5，pH: 7.27.4。2. 秋水仙素处理时间：24小时，不能过长或过短。时间过长，分裂细胞多，染色体短小；反之，则少而细长。3. 低渗的浓度和时间：3.5%和25分钟。低渗使红细胞破裂，淋巴细胞膨胀、肿大。混匀细胞要轻，否则引起膜破裂，染色体丢失。4. 去上清时必须要用吸管吸，否则目的物会丢失。5. 离心前一定要配平，否则会损坏离心机。离心速度过高，细胞团不易打散；反之，细胞易丢失。6. 固定液使用前临时配制。7. 载玻片一定要洁净，否则染色体分散性不好。作业与思考1. 如果低渗不足或低渗过度，会出现什么情况？2. 分析实验中遇到的各种问题。实验四 人体间期细胞X-小体的制备实验目的1了解人体间期细胞X-小体的制备2掌握Lyon假说的内容实验原理1949年Barr等发现，在雌性体细胞中的两条X染色体有一条（或这条的大部分）处于凝集不活动的状态，从而形成X-小体（或称X-染色质、性染色质、Barr）小体。进而发现，所有哺乳类雌体细胞中都有一条这种表现的X染色体。当在个别雌或雄体中，有多于2条X染色体时，在间期细胞内除一条外，其余均形成X-小体。人类正常的男女体细胞中，22对常染色体并无区别，但其性染色体分别为XY和XX。女性的两条X染色体中，有一条在间期呈现浓缩状态，可由适当的染料显示。正常女性