酸性纤维素酶对红茶菌产膜量的影响-周鹏宇.doc

安徽科技学院 食品药品学院 本科毕业论文本科生毕业论文（设计）题 目: 酸性纤维素酶对红茶菌产膜量的影响 姓 名: 周鹏宇 学 院: 食品药品学院 专 业: 食品质量与安全 班 级: 061 学 号: 2006674131 指导教师: 孙永康 职称: 讲师 2010年 6 月 8日安徽科技学院教务处制目 录摘要1关键词1前言11 材料与方法11.1材料21.1.1 原料21.1.2 试剂21.1.3 仪器与设备21.2 方法21.2.1 技术路线21.2.2 操作要点21.3 检测方法 31.3.1葡萄糖标准浓度曲线绘制31.3.2酸性纤维素酶活力的测定31.3.3 纤维素膜重的称量42 结果与分析52.1酸性纤维素酶不同加入时间对红茶菌产模量的影52.2不同浓度的纤维素酶对红茶菌产模量的影52.3红茶菌不同接种量对红茶菌产膜量的影响52.4不同培养基加入量对红茶菌产膜量的影响52.5初始pH的不同对红茶菌产膜量的影62.6不同温度对红茶菌产膜量的影响62.7酸性纤维素酶对红茶菌产膜量影响因素的优选63 讨论73.1 酸性纤维素酶加入时间确定83.2 纤维素酶浓度的确定83.3 红茶菌接种量的确定83.4 培养基加入量的确定83.5 初始pH的确定83.6 发酵液温度的确定94 结论9致谢9参考文献10安徽科技学院 食品药品学院 本科毕业论文酸性纤维素酶对红茶菌产膜量的影响食品质量与安全：周鹏宇指导老师：孙永康摘要：本文对酸性纤维素酶在不同条件下对红茶菌产膜量的影响进行了研究。通过单因素实验和正交实验对红茶菌发酵过程中加入酸性纤维素酶的各种发酵参数进行优化选择。实验结果表明在46、初始pH5.0、0.12%酸性纤维素酶、红茶菌10%、培养基加入量60%的条件下纤维素酶对红茶菌产膜情况影响效果最好，可有效的抑制纤维素膜的产生。关键词：红茶菌， 酸性纤维素酶， 产膜量， 发酵， 影响前言红茶菌是一种有着悠久历史的传统功能性饮料。具有多种保健作用，也是一种很有利用价值的天然微生物发酵产品。茶菌中有益的微生物主要由乳酸菌，酵母菌，醋酸菌组成1，通过其的特殊作用，将糖、茶等原料经过生物技术发酵工艺转化为极其丰富的营养物质(如葡萄糖酸、葡萄糖醛酸、D-葡萄糖二酸-1,4内酯、乳酸、醋酸、维生素、多糖、蛋白等)，使糖茶水成为一种甘甜可口的饮料2。其功能主要体现在清理肠胃、消除疲劳、增强食欲、帮助消化、防治高血压和动脉硬化、预防和治疗糖尿病、以及防癌抗癌以及增强机体免疫力等3。据专家预测，21世纪的饮料市场将是茶饮料的世界。中国是世界茶叶的发源地，也是世界上最大的茶叶生产国。尽管我国茶饮料工业起步较晚，但发展势头十分强劲。基于红茶菌的保健作用，人们对各种红茶菌饮料的开发研究产生了格外的兴趣。同时红茶菌发酵产物中的细菌纤维素在食品、造纸、医疗等有着广泛的应用，国内外学者对如何提高细菌纤维素产量也作了相应的研究4。在对红茶菌饮料的开发生产时，在发酵过程中产生的细菌纤维素膜一直是阻碍各生产企业对其的品质提升以及扩大再生产的重要因素5。解决这一问题就显得十分重要，然而对于红茶菌饮料发酵过程中所产生的细菌纤维素膜的解决的研究确寥寥无几。因此对红茶菌发酵时产生的细菌纤维素膜的防治的研究具有重要的经济意义。本文根据细菌纤维素膜的成分特点，在红茶菌发酵时加入酸性纤维素酶，并且在不同条件下研究酸性纤维素酶对红茶菌产膜量的影响。通过实验找出最佳工艺参数为解决红茶菌饮料生产时的产膜问题提供参考。1 材料与方法1.1 材料1.1.1 原料红茶菌：安徽科技学院食品微生物实验室保藏；红茶：市售；白砂糖：市售食品级。1.1.2 试剂柠檬酸、柠檬酸钠、酒石酸钾纳、无水硫酸钠、苯酚、3,5-二硝基水杨酸、氢氧化钠、羧甲基纤维素钠、葡萄糖，以上均是分析纯试剂。酸性纤维素酶-湖南利尔康生物有限公司。1.1.3 仪器与设备FA2104电子天平：上海精密科学仪器有限公司；YP3001N电子天平：上海精密科学仪器有限公司；HH-B11电热恒温培养箱：上海跃进医疗器械厂；LS-B50L立式压力蒸汽灭菌器：上海华线医用核子仪器有限公司；SD-28加热水浴锅：上海精宏实验设备有限公司；GZX-9076 MBE 数显干燥箱：上海博讯事业有限公司医疗设备厂。1.2 方法1.2.1 技术路线 酸性纤维素酶 红茶糖水的配制红茶菌的扩培接种发酵过滤称重1.2.2 操作要点1.2.2.1 红茶糖水的配制以茶叶，蔗糖，蒸馏水质量比为1:20:500的比例，将其加热煮沸，然后过滤至棕色瓶中（用8层纱布封口）灭菌后备用。1.2.2.2 红茶菌的扩培取4.0g茶叶，320g蔗糖，蒸馏水2000mL，在一起加热煮沸，然后滤去茶叶并将茶糖水移至棕色瓶中（用8层纱布封口），最后放入高压杀菌锅中灭菌15min。取出灭菌过的培养基，在无菌操作台中将红茶菌小心接种在棕色瓶中。将接种过的红茶菌培养基放入37的恒温箱发酵培养7天。1.2.2.3 酸性纤维素酶的加入时间对红茶菌产膜量的影响以红茶菌接种量20%，培养基量为总体积的70%，发酵温度37，在红茶菌接种当时即0天、1，2，3，4，5，6，7天时向发酵液中加入0.12%的酸性纤维素酶进行试验，测定结果。1.2.2.4 纤维素酶浓度对红茶菌产膜量的影响红茶菌接种量20%，培养基量70%，发酵温度37，在接种红茶菌的同时加入0、0.04、0.08、0.12、0.16、0.20、0.24浓度的纤维素酶进行试验，测定结果。1.2.2.5 不同红茶菌接种量对红茶菌产膜量的影响按培养基量为总体积的70%，同时加入0.12%酸性纤维素酶，发酵温度37的条件下进行茶菌接种量分别为5%、10%、15%、20%、25%、30%时对产膜量的影响试验。1.2.2.6 培养基量对红茶菌产膜量的影响同时向培养基的量为45%、50%、55%、60%、65%、70%中加入20%的红茶菌和0.12%的酸性纤维素酶在发酵温度37的条件下进行试验，测定结果。1.2.2.7 初始pH对红茶菌产膜量的影响按培养基量为70%，同时加入20%红茶菌液和0.12%酸性纤维素酶在发酵温度37的条件下，调节各培养基的初始pH分别为3.0、3.5、4.0、4.5、5.0、5.5、6.0进行试验，测定结果。1.2.2.8 温度对红茶菌产膜量的影响以培养基量为70%，同时加入20%红茶菌和0.08%酸性纤维素酶，在发酵温度分别为35、37、40、43、46、50、53下进行试验，测定结果。1.2.2.9 正交试验的建立根据各单因素试验结果按照表1和表2进行正交试验。1.3 检测方法1.3.1葡萄糖标准浓度曲线绘制1.3.1.1 1lmg/mL标准葡萄糖溶液精确称取105干燥2h的分析纯葡萄糖0.5000g加水溶解，稀释定容至500mL。1.3.1.2葡萄糖标准浓度曲线的绘制分别取0.2、0.4、0.6、0.8、1.0、1.2mL的1mg/mL的葡萄糖标准溶液和2mL3，5-二硝基水杨酸试剂（DNS试剂）于不同编号的25mL容量瓶中。并用去离子水将各容量瓶补至4mL。在沸水浴中反应10min，冷却后定容到25mL。在max=492nm下，用紫外分光光度计测定吸光度值，以吸光度值为纵坐标，葡萄糖含量为横坐标，绘制标准曲线6。葡萄糖标准曲线如图1所示。其回归方程为y=27.999x-0.1085，线性相关系数R2=0.9988，线性很好可以用此进行纤维素酶活力测定。 1.3.2 酸性纤维素酶活力的测定1.3.2.1酸性纤维素酶酶液制备取酸性纤维素酶粉2.09g加200mL的去离子水，搅拌均匀后，于40水浴中保温45min，用脱脂棉过滤到三角瓶中密封置冰箱中冷藏待用7。1.3.2.2 酶活力测定方法采用3，5-二硝基水杨酸(DNS)法8在45、pH5.0、酶促反应30min条件下测得酶活力为1334 IU/g。1.3.3 纤维素膜重的称量将菌膜取出后用清水进行漂洗，在自然状态下放置风干半小时后于分析天平上称量其膜重量。图1 葡萄糖标注曲线Fig 1The curve of glucose standard concentration 表1正交试验因素和水平Table 1 The factors and levels of the orthogonal experiment水平因素初始pH温度（）红茶菌接种量（%）酸性纤维素酶浓度（%）14.540100.0825.043200.1235.546300.16表2 L9(34)表Table 2 L9(34)试验号A初始pHB温度（）C红茶菌接种量（%）D酸性纤维素酶浓度(%)1111121222313334212352231623127313283213933212 结果与分析2.1 酸性纤维素酶加入时间对红茶菌产模量的影响以红茶菌接种量20%，培养基量为总体积的70%，发酵温度37，在不同的时间下向发酵液中加入0.12%的酸性纤维素酶进行试验，测得试验结果见表3。表3酸性纤维素酶不同加入时间对红茶菌产模量的影响Tab.3 Effect of adding acid cellulose enzyme at different time on film production of Kampuchea加入时间（d）00.51.01.52.02.53.0膜重（g）0.0098 0.0095 0.0098 0.0100 0.0097 0.0103 0.0102 根据表3可知酸性纤维素酶的不同加入时间对红茶菌产模量影响不大。随着纤维素酶的加入时间的推迟各试验组红茶菌的产模量均在0.0098g附近稍有波动。考虑到试验效率选取红茶菌接种的同时加入酸性纤维素酶。2.2 浓度的纤维素酶对红茶菌产模量的影响红茶菌接种量20%，培养基量70%，发酵温度37，在接种红茶菌的同时加入不同浓度的纤维素酶进行试验，根据试验方法测得膜重如下表4所示：表4不同浓度酸性纤维素酶的加入对红茶菌的产膜量的影响Tab.4 Effect of adding acid cellulose enzyme at different consistence on film production of Kampuchea纤维素酶浓度0%0.04%0.08%0.12%0.16%0.20%0.24%膜重（g）0.05420.03510.02030.01000.00000.00000.0000由表可知随着酸性纤维素酶浓度的增加红茶菌产膜量逐渐的减少。当酸性纤维素酶浓度达到0.16%或大于0.16%时红茶菌产膜量为零即无膜产生，即当酸性纤维素酶在0.16%时可有效的抑制红茶菌纤维素膜的产生。考虑试验成本，本试验选取酸性纤维素酶浓度为0.16%。2.3 红茶菌接种量对红茶菌产膜量的影响按培养基量为总体积的70%，同时加入0.12%酸性纤维素酶，发酵温度37的条件下进行不同红茶菌接种量对产膜量的影响试验。根据试验方法测得各组试管膜重如下表5所示：表5红茶菌不同接种量对红茶菌产膜量的影响Tab.5 Effect of adding different amount of Kampuchea on film production of Kampuchea红茶菌接种量（%）51015202530膜重（g）0.00000.00000.00740.01150.02870.0312由表可知随着红茶菌接种量的增加红茶菌产膜量有着增加的趋势。红茶菌接种量为5%、10%时均无膜产生，其后膜重逐渐增加。当红茶菌接种量超过25%时，膜重量变化减小。选取红茶菌接种量在10%以内。2.4 培养基加入量对红茶菌产膜量的影响同时向不同量的培养基中加入20%红茶菌和0.12%酸性纤维素酶在发酵温度37的条件下进行试验，测得各组试管膜重如下表6所示：表6不同培养基加入量对红茶菌产膜量的影响Tab.6 Effect of adding different amount of substrate on film production of Kampuchea培养基量（%）455055606570膜重（g）0.00000.00000.00000.00000.00820.0102根据表6所示可知培养基加入量小于60%时，各组试验结果膜重量均为零即都无膜产生。培养基量为65%时有膜产生，其后随着培养基加入量的逐渐增加膜重量也相应的随之增加。本试验选取培养基加入量为60%以内。2.5 初始pH的对红茶菌产膜量的影响按培养基量为70%，同时加入20%红茶菌液和0.12%酸性纤维素酶在发酵温度37的条件下，调节各培养基的初始pH进行试验，根据试验方法测得各组试管膜重如下表7所示：表7初始pH的不同对红茶菌产膜量的影响Tab.7 Effect of different initial pH on film production of KampucheapH3.03.54.04.55.05.56.0膜重（g）0.03200.02350.01840.01030.00000.01090.0258根据表7可知初始pH的不同对红茶菌产膜量有影响。初始pH在 3.05.0之间随着pH的增大，红茶菌产膜量逐渐减少；当初始pH大于5.0时，随着pH的继续增加红茶菌产膜量又有所增加。初始pH为5.0时膜重为零即无膜产生，所以本试验选取初始pH为5.0。2.6 温度对红茶菌产膜量的影响以培养基量为70%，同时加入20%红茶菌和0.08%酸性纤维素酶，在不同的发酵温度下进行试验，测定各组试管膜重结果如下表8所示：表8不同温度对红茶菌产膜量的影响Tab.8 Effect of different temperature on film production of Kampuchea温度（）35374043465053膜重（g）0.03800.02090.01340.00860.00000.00000.0000根据表8中的数据可以看出随着温度的逐渐升高红茶菌的产膜量呈逐渐降低的趋势。当温度达到46 后，称取膜重量均为零即都没有膜产生。考虑到能耗与试验条件达到的难易，本试验采用发酵温度为46。2.7 酸性纤维素酶对红茶菌产膜量影响因素的优选通过单因素试验可知，酸性纤维素酶的浓度、红茶菌接种量、发酵液pH、温度是决定酸性纤维素酶对红茶菌产膜量影响的主要因素。所以在单因素试验基础上选择酸性纤维素酶的浓度、红茶菌接种量、初始pH、温度四个因素，并选取三个适宜的水平进行正交试验。在培养基量为60%，红茶菌接种同时加入酸性纤维素酶的条件下，通过正交试验的到各组膜重量见表9。表9 正交试验结果Table 9 The results of sensory evaluation 试验号A初始pHB温度C红茶菌接种量D 酸性纤维素酶浓度膜重111110.0201212220.0086313330.0000421230.0000522310.0235623120.0000731320.0175832130.0000933210.03140.02870.03760.03760.0750T=0.10110.02350.03210.04000.02610.04890.03140.04100.00000.00960.01250.01250.02500.00780.01070.01330.00870.01630.01050.01370.0000R较优水平0.0085A20.0021B30.0011C10.0250D3因素主次DABC从正交试验计算极差的大小可以看出在试验水平范围内，各因素对红茶菌产膜量的影响力为DABC，即酸性纤维素酶浓度对红茶菌产膜量影响最大，其次是发酵液的pH、发酵温度，红茶菌接种量对红茶菌产膜量的影响最小。根据正交试验感官评定结果和极差分析，膜重量最小的组合分别是A1B3C3D3、A3B2C1D3、A2B1C2D3、A2B3C1D2，最优组合是A2B3C1D3，该组合在正交试验中没有出现，需要做验证试验。验证试验结果五组处理中红茶菌产膜量均为零，考虑到因素对红茶菌产膜量的影响力大小与试验成本，选择最佳发酵参数为A2B3C1D2，即酸性纤维素酶浓度为0.12%，初始pH为5.0，温度46，红茶菌接种量为10%。3讨论3.1 酸性纤维素酶加入时间的确定酸性纤维素酶的不同加入时间对红茶菌产膜量没有太大的影响。观察各试验组结果可知，虽然酸性纤维素酶的加入时间不同但膜重量变化不大。各组试验结果均在0.0098g附近波动，且波动值在称量误差5%以内。若不再接种红茶菌的同时加入酸性纤维素酶则会增大工作量，同时增大了污染杂菌的风险，因此本试验选取在同一时间接种红茶菌和加入酸性纤维素酶。张永凤等9液态淋浇食醋发酵生产中细菌纤维素膜的防治研究中所选取的时间为在接种军中的同时加入酸性纤维素酶相同。3.2 酸性纤维素酶浓度的确定随着酸性纤维素酶浓度的逐渐加大红茶菌的产膜量逐渐减少。酸性纤维素酶浓度小了则达不到抑制膜产生的效果；大了则增加了试验的成本。本实验中酸性纤维素酶浓度为0.16%时可以有效地抑制细菌纤维膜的产生。这与张永凤等9液态淋浇食醋发酵生产中细菌纤维素膜的防治研究中的0.08%有所不同，主要是因为所选用的酸性纤维素酶不同且在不同的实验条件下酸性纤维素酶的活力有所不同。3.3 红茶菌接种量的确定随着红茶菌接种量的增加红茶菌产膜量有着增加的趋势。这是因为随着红茶菌接种量的增加红茶菌生长的对数期时间减少，对数期消耗的营养成分减少导致稳定期时间延长，致使发酵产物纤维素膜有所增加。同时当菌种量大于25%以后增长趋势明显减小，是由于接种量基数相对过大使得菌种生长的对数期极短且相互之间相差不大导致的。因此当膜量在控制范围内时可适当的增加红茶菌的接种量来增加发酵后的风味。结合单因素试验与正交试验的结果，确定红茶菌接种量为10%。3.4 发酵液初始pH的确定红茶菌的最适pH为4.510，纤维素酶最适pH为5.011。初始pH在3.04.5之间随着pH的增大，红茶菌产膜量逐渐减少在此pH内随着pH的增大红茶菌与纤维素酶活力都有所增加，但纤维素酶活力增加速度大于红茶菌增加速度。初始pH从4.55.0膜重继续减少是由于在此pH内纤维素酶活力继续增加而红茶菌活力开始降低引起的。随着pH的继续增加红茶菌产膜量又有所增加。这是因为随着pH的增加纤维素酶与红茶菌的活力都有所降低，但纤维素酶活力降低的速度大于红茶菌活力的降低速度。结合单因素与正交试验结果，本试验确定初始pH为5.0。3.5 发酵温度的确定红茶菌最适生长温度3512。在试验温度范围内，随着温度的逐渐升高红茶菌的产膜量呈逐渐降低的趋势。这是由于在此温度范围内随着温度的升高逐渐达到纤维素酶的最适温度使得纤维素酶活力逐渐增强；同时随着温度的升高红茶菌的活力逐渐降低所引起的。随着温度的升高，为了达到温度所消耗的能源也增多，因此在达到试验目的的同时降低温度可减少能耗。结合单因素与正交试验结果，本试验选择发酵温度为46。4 结论通过单因素试验和正交试验结果，考虑到试验的成本与效率得出酸性纤维素酶对红茶菌发酵过程中抑制产膜的最佳工艺参数为在接种红茶菌的同时加入酸性纤维素酶浓度为0.12%，初始pH为5.0，温度46，红茶菌接种量为10%，培养基量60%。在此参数条件下红茶菌整个发酵过程中均无膜产生。致谢在毕业论文的整个过程中，我虽然尽心尽力，查阅大量资料，投入大量时间和精力，但终因学识有限，在设计、实验以及论文修改等方面仍有很多自己难以解决的问题，孙永康老师毫无保留的悉心指导，帮我渡过一个个难关。一年以来，导师的教诲和帮助，将使我终生受益。同时感谢郑海波老师的帮助。感谢四年来所有老师的悉心指教，使我能够顺利完成学业！参考文献1吴薇,盖宝川,籍保平.红茶菌混合菌种的分离和鉴定J.食品科学,2004,25(4):55-58.2刘士清.民间红茶菌的医疗保健作用J.中国民族民间医药杂志,1996(20):19-21.3左勇,周健.红茶菌酒饮料的研究J.四川食品与发酵,2004(2):25-27.4Brown AL.On an acetic ferment which forms cellulose J.J.Chem.Soc.，1886(49)432-439.5谢恺熙,蓝卫.对传统食醋液态淋浇发酵塔的改进方法J.中国调味品,2001(4):9-33.6张永凤.食醋淋浇发酵生产中菌膜产生机理和防治的研究(D).贵州:贵州大学硕士论文,2008:35.7夏服宝,邱雁临,孙宪迅.纤维素酶活力测定条件研究J.饲料工业,2005，26(16):23-26.8赵玉萍，杨娟.四种纤维素酶酶活测定方法的比较J.食品研究与开发,2006,27(3):116-118.9张永凤,卢红梅,张凤娟等.液态淋浇食醋发酵生产中细菌纤维素膜的防治研究J.江苏食品与发酵,2007(4):2-3.10左勇.发酵法制备红茶菌酒饮料工艺及稳定性研究J.食品科学,2005,26(7):137.11张永凤.食醋淋浇发酵生产中菌膜产生机理和防治的研究(D).贵州:贵州大学硕士论文，2008:36.12谢俊杰,佘世望.培养条件对红茶菌生长及抗菌作用的影响