高考生物总复习 第六章第2节 DNA片段的扩增 PCR技术课件 中图版选修1.ppt

第2节dna片段的扩增 pcr技术 学习导航1 理解pcr扩增dna片段的原理 重点 2 尝试pcr技术的基本操作和应用 难点 一 dna在细胞内的复制1 所需的酶 酶 dna聚合酶和rna聚合酶等 2 引物 3 原料 4 原则 dna解旋 一段rna 四种脱氧核苷酸 碱基互补配对原则 二 pcr及其过程1 概念 pcr即聚合酶链式反应 实际上是在 模拟细胞内的 形成大量 的dna片段 体外 dna复制过程 特异性 2 过程 dna模板 氢键 一对引物 dna聚合 脱氧核苷酸 判一判 1 细胞内dna复制和pcr技术所需的引物一样 都是rna 2 经pcr技术合成的dna分子中 每条单链都含有引物 3 pcr实验的原理和操作都十分复杂 不易于操作 4 经过高温变性 低温复性和中温延伸三步操作 dna片段可呈指数增长 三 实验操作1 准备 1 为了避免 等因素的污染 pcr实验中使用的微量离心管 吸头 缓冲液以及蒸馏水等在使用前必须进行 2 如果没有pcr仪 可以设置3个恒温水浴锅 温度分别为 和 然后按要求在3个水浴锅中来回转移pcr的微量离心管即可 外源dna 高压灭菌 95 55 72 pcr热循环 260nm 想一想决定pcr反应特异性的原因有哪些 提示 待扩增dna片段的特异性 要点一pcr技术与体内dna复制的比较 特别提醒 pcr反应需要可变的温度 而体内dna复制需要稳定的温度 dna解旋酶的作用是使dna两条链的氢键断开 dna聚合酶的作用是将单个脱氧核苷酸加到已有的单链片段的3 端上 需要模板 dna连接酶连接的是两条dna片段的缺口 不需要模板 pcr过程与细胞内的dna复制过程相比 主要有两点不同 它们是 pcr过程需要的引物是人工合成的单链dna pcr过程不需要dna聚合酶 pcr过程中dna的解旋不依靠解旋酶 而是通过对反应温度的控制来实现的 pcr过程中 dna不需要解旋 直接以双链dna为模板进行复制 a b c d 解析 pcr过程与细胞内的dna复制过程相比较 主要有两点不同 pcr过程需要的引物是人工合成的单链dna 长度通常为15 40个核苷酸 pcr过程中 dna解旋不依赖解旋酶 而是通过对反应温度的控制来实现的 答案 c 变式训练 2012 成都七中高二检测 下列关于dna复制和pcr的描述中 正确的是 a dna聚合酶不能从头开始合成dna 只能从5 端延伸dna链b dna复制不需要引物c 引物与dna母链通过碱基互补配对进行结合d pcr扩增的对象是氨基酸序列 解析 选c 由于dna聚合酶不能从头开始合成dna 只能从3 端延伸dna链 故dna复制需要引物 而且它与dna母链通过碱基互补配对结合 pcr扩增的对象是dna 而不是氨基酸 2 pcr扩增过程 图示 3 dna扩增数目的理论计算理论上dna扩增呈指数增长 若只有一条dna模板 则复制n次后有2n条 若一开始有m条dna模板 则复制n次后有m 2n条 实际操作过程中 由于无关变量的影响 一般来说实验值要略小于理论值 近20年来 pcr技术 多聚酶链式反应 成为分子生物学实验室的一种常规实验手段 其原理是利用dna半保留复制 在试管中进行dna的人工复制 如图 在短时间内 将dna扩增几百万倍甚至几十亿倍 从而使实验室所需要的遗传物质不再受限于活的生物体 1 加热使dna双链间的 键完全打开 称为 而在细胞中是在 酶的作用下进行的 2 如果只需要大量克隆模板dna中间的某个特定区段 应该加入 种特定的引物 当温度降低至55 c时 引物与两条 舒展 的模板的特定位置结合 在dna聚合酶的作用下 只能在引物的 端连接脱氧核苷酸 两条子链的延伸方向都是 3 pcr技术的必需条件 除了模板 原料 酶之外 至少还有三个条件 即液体环境 适宜的 和 前者由 自动调控 后者则靠 来维持 4 通过pcr技术使dna分子大量复制 如果将一个用15n标记的dna分子放入试管中 以14n标记的脱氧核苷酸为原料 连续复制四次之后 则15n标记的dna分子占全部dna分子总数的比例是 解析 1 pcr技术利用热变性原理使dna双链之间的氢键断裂 称为变性 而在细胞内是在解旋酶的作用下使氢键断裂 2 pcr分为三个基本反应步骤 变性 95 复性 55 延伸 72 其特异性依赖于与靶序列互补的引物 引物是两段与待扩增dna序列互补的片段 两引物之间的距离决定扩增片段的长度 由于dna聚合酶不能从头开始合成dna 只能从引物的3 端延伸dna链 则dna的合成方向总是从子链的5 端向3 端延伸 3 pcr技术与细胞内的dna复制不完全相同 除了需要模板 原料 酶以外 至少还需要液体环境 稳定的缓冲液 每一个步骤需要适宜的温度和酸碱度等 4 一个dna分子连续复制四次之后 形成16个dna分子 15n标记的dna分子有2个 则15n标记的dna分子占全部dna分子总数的比例为1 8 答案 1 氢变性解旋 2 两3 从子链的5 端向3 端延伸 3 温度酸碱度pcr仪缓冲液 4 1 8 互动探究 1 pcr中由碱基错配而引起哪种变异 2 假设对一个dna进行扩增 第一次循环时某一条模板链上发生碱基错配 则扩增若干次后检测所用dna的扩增片段 与原dna相应片段相同的占多少 提示 1 基因突变 2 50 误区警示 关于dna的扩增方向容易发生混淆 为了明确表示dna的方向 通常将dna的羟基 oh 末端称为3 端 磷酸基团的末端称为5 端 子链从引物3 端开始延伸 而子链的合成方向是从5 端向3 端延伸 要点三实验操作与结果分析1 检测pcr扩增效果的过程 2 结果分析dna片段的扩增是否成功的判断 1 对于电泳检测的方法 可以通过在紫外线下直接观察dna带的分布及粗细程度来评价扩增的效果 2 扩增不成功的可能原因有 漏加了pcr的反应成分 各反应成分的用量不当 pcr程序设置不当等 在pcr扩增dna的实验中 预计一分子dna经过30次循环后 应该得到230个dna分子 但是结果只有约210个dna分子 那么不是出现该现象的原因是 a taqdna聚合酶的活力不够 或活性受到抑制b 系统设计欠妥c 循环次数不够d 复性时 部分亲链与亲链结合 解析 如果taqdna聚合酶活力不够 或活性受到抑制 则导致催化效率降低 得到的产物比预期的少 如果pcr系统设置不妥 达不到预期的结果 复性时 模板链既可以和引物结合 互补的模板链也可