实时荧光定量PCR技术的原理及应用.ppt

实时荧光定量PCR技术的原理及应用 RealtimeQuantitativePCR 讲座提纲 实时荧光定量PCR原理实时荧光定量PCR的几种方法介绍实时荧光定量PCR医学和科研中的应用 实时荧光定量PCR原理实时荧光定量PCR的几种方法介绍实时荧光定量PCR医学和科研中的应用 实时荧光定量PCR定义 在PCR反应体系中加入荧光基团 利用荧光信号累积实时监测整个PCR进程 最后通过标准曲线对未知模板进行定量分析的方法 实时荧光定量PCR原理实时原理 常规PCR技术 对PCR扩增反应的终点产物进行定量和定性分析无法对起始模板准确定量 无法对扩增反应实时检测 实时定量PCR技术 利用荧光信号的变化实时检测PCR扩增反应中每一个循环扩增产物量的变化 通过Ct值和标准曲线的分析对起始模板进行定量分析 实时荧光定量PCR原理定量原理 介绍三个概念 扩增曲线 荧光阈值 Ct值 如何对起始模板定量 通过Ct值和标准曲线对起始模板进行定量分析 实时荧光定量PCR原理 扩增曲线 实时荧光定量PCR原理 荧光阈值 荧光信号阈值 threshold 前15个循环信号作为荧光本底信号 baseline 即样本的荧光背景值和阴性对照的荧光值荧光域值的缺省设置是3 15个循环的荧光信号的标准偏差的10倍手动设置 原则要大于样本的荧光背景值和阴性对照的荧光最高值 同时要尽量选择进入指数期的最初阶段 并且保证回归系数大于0 99真正的信号 荧光信号超过域值 实时荧光定量PCR原理 Ct值 Ct值的定义 PCR扩增过程中 扩增产物的荧光信号达到设定的阈值时所经过的扩增循环次数 实时荧光定量PCR原理 Ct值的重现性 Ct值的特点 相同模板进行96次扩增 终点处产物量不恒定 Ct值则极具重现性 实时荧光定量PCR原理 定量原理 理想的PCR反应 X X0 2n非理想的PCR反应 X X0 1 Ex nn 扩增反应的循环次数X 第n次循环后的产物量X0 初始模板量Ex 扩增效率 实时荧光定量PCR原理 定量原理 在扩增产物达到阈值线时 XCt X0 1 Ex Ct M 1 XCt 荧光扩增信号达到阈值强度时扩增产物的量 在阈值线设定以后 它是一个常数 我们设为M方程式 1 两边同时取对数得 logM logX0 1 Ex Ct 2 整理方程式 2 得 logX0 log 1 Ex Ct logM 3 Log浓度与循环数呈线性关系 根据样品扩增达到域值的循环数即Ct值就可计算出样品中所含的模板量 实时荧光定量PCR原理 标准曲线 模板DNA量越多 荧光达到域值的循环数越少 即Ct值越小Log浓度与循环数呈线性关系 通过已知起始拷贝数的标准品可作出标准曲线 根据样品Ct值 就可以计算出样品中所含的模板量 确定未知样品的C t 值通过标准曲线由未知样品的C t 值推算出其初始量 实时荧光定量PCR原理绝对定量 讲座提纲 实时荧光定量PCR原理实时荧光定量PCR的几种方法介绍实时荧光定量PCR实验设计及应用 实时荧光定量PCR原理实时荧光定量PCR的几种方法介绍实时荧光定量PCR实验设计及应用 非特异性荧光标记 1 SYBRGreen特异性荧光标记 2 TaqMan3 MolecularBeacon4 Amplisensor 实时荧光定量PCR原理 DNA产物的荧光标记 实时荧光定量PCR方法1 SYBRGreen法 SYBRGreen SYBRGreen法工作机理 SYBRGreen能结合到双链DNA的小沟部位 SYBRGreen只有和双链DNA结合后才发荧光变性时 DNA双链分开 无荧光复性和延伸时 形成双链DNA SYBRGreen发荧光 在此阶段采集荧光信号 SYBRGreen 实时荧光定量PCR原理SYBRGreenI工作原理 实时荧光定量PCR原理SYBRGreenI熔解曲线分析 实时荧光定量PCR原理SYBRGreenI熔解曲线分析 将温度与荧光强度的变化求导 dI dT Tm SYBRGreen法融解曲线分析 Cyclenumber SYBRGreen法定量原理 模板DNA量越多 荧光达到域值的循环数越少Log浓度与循环数呈线性关系 根据样品Ct值 就可以计算出样品中所含的模板量 SYBRGreen法 PCR反应的建立 反应体系的建立及优化 SYBRGreen使用浓度 太高抑制Taq酶活性 太低 荧光信号太弱 不易检测Primer 引物的特异性高 否则扩增有杂带 定量不准MgCl2的浓度 可以降低到1 5mM 以减少非特异性产物反应Buffer体系的优化反应温度和时间参数 由酶和引物决定其他与常规PCR相同 天为时代公司利用SYBRGreen法定量检测样品DNA SYBRGreen法应用范围 起始模板的测定基因型的分析融解曲线分析 可以优化PCR反应的条件 对常规PCR有指导意义 如对primer的评价 可以区分单一引物 引物二聚体 变异产物 多种产物 SYBRGreen法优缺点 实时荧光定量PCR方法2 TaqMan法 TaqMan 水解型杂交探针 5 端标记有报告基团 Reporter R 如FAM VIC等3 端标记有荧光淬灭基团 Quencher Q 探针完整 R所发射的荧光能量被Q基团吸收 无荧光 R与Q分开 发荧光Taq酶有5 3 外切核酸酶活性 可水解探针 TaqMan法工作原理 每扩增一条DNA分子 释放一个荧光信号 可以在循环过程中任一点检测荧光 TaqMan法PCR反应的建立 1 引物 探针的设计 探针Tm为68 70 30bp 5 不能有G G可能会淬灭荧光素 引物尽量靠近探针 扩增片段 400bp 引物Tm为59 60 2 反应参数的确定 一般为 94 10 20S60 30 60S Taq酶5 3 外切核酸酶活性在60 最高 也可通过温度梯度优化退火温度72 45S 3 优化引物和探针浓度 获得最小Ct值 最大信号 背景比值引物浓度 50 900nM探针浓度 50 250nM4 其他与常规PCR相同 已肝病人血液中HBV的绝对定量目的 利用核酸检测 缩短检验时间 提高灵敏度 为诊断用药提供依据方法 从血液中提取病毒DNA 扩增病毒基因 以TaqMan探针进行检测设置对照 浓度为106 105 104103的标准样品各一个 设阴性和空白对照实验步骤 提取HBVDNA设计特异引物设计TaqMan探针并标记探针扩增程序结果 获取血液样品中HBVDNA的精确copy数 利用TaqMan法检测血液中的HBV 数据分析 分析结果 HBVDNA的精确copy数为3 7X105 利用TaqMan法检测血液中的HBV TaqMan法应用范围 起始模板的定量基因型分析目的基因定量产物鉴定SNP分析 TaqMan法优缺点 实时荧光定量PCR方法3 Molecularbeacon法 分子信标 标记荧光的发夹探针环与目标序列互补茎由互补配对序列组成 发夹型杂交探针 Molecularbeacon 分子信标 工作原理 荧光共振能量转移 FRET 探针与DNA杂交时产生荧光 变性过程 产生非特异性荧光 延伸过程 不产生荧光 退火过程 产生特异性荧光 检测荧光信号 Molecularbeacon 分子信标 应用范围 起始模板的定量基因型分析产物鉴定SNP 单核苷酸多态性 分析 Molecularbeacon 分子信标 优缺点 讲座提纲 实时荧光定量PCR原理实时荧光定量PCR的几种方法介绍实时荧光定量PCR实验设计及应用 实时荧光定量PCR原理实时荧光定量PCR的几种方法介绍实时荧光定量PCR实验设计及应用 实时荧光定量PCR法标准样品 相对定量中的内标内标通常是 actin GAPDH基因等看家基因在细胞中的表达量或在基因组中的拷贝数恒定 受环境因素影响小内标定量结果代表了样本中所含细胞或基因组数量 绝对定量的标准样品 已知拷贝数的质粒DNA和体外转入的RNA 实时荧光定量PCR法标准样品DNA拷贝数 用于生成标准曲线的样品如何设定 含有和待测样品相同扩增片段的克隆质粒含有和待测样品相同扩增片段的cDNA紫外分光光度计或荧光酶标测定浓度根据质粒或cDNA分子量换算成拷贝数 做系列稀释 实时荧光定量PCR法定量方法 绝对定量检测起始模板数的精确拷贝数 通常用到标准曲线相对定量确定经过不同处理的样本目标转录本之间基因的表达差异 不同时相 2 C t 双标准曲线法 实时荧光定量PCR法TaqMan法举例 TaqMan法研究ERBB2在乳腺肿瘤组织标本中的表达差异 TaqMan法举例标记探针 使用TaqMan探针进行双通道荧光定量 Fam标记目标基因探针VIC标记看家基因探针 TaqMan法举例材料准备 从正常乳腺组织中提取的总RNA从乳腺癌组织中提取的总RNA含ERBB2andGAPDH的质粒用于生成标准曲线单双通道同时进行 独立分析ControlsnoRNA 阴性对照RNA noreversetranscriptase 基因组对照 TaqMan法举例反应程序 RT qPCR反应程序 TaqMan法举例癌症标记物表达 Color2 VICdetectionforGAPDH Color1 FAMdetectionforERBB2 TaqMan法举例实验结果单双通道相互验证 TaqMan法举例实验结果定量 Copiesng lTotalRNA TaqMan法举例实验结果定量分析 ERBB2copies GAPDHcopies 1095 95500 0 0111052 85730 0 012 2130 136000 0 0172492 130800 0 019 HealthyRNA TumorRNA 0 0115 0 018 Copiesng lTotalRNA TaqMan法举例实验结果表达差异 HealthyTissue Carc Tissue RelativeExpression ERBB2的表达差异 TaqMan法举例实验结果讨论 通过RT qPCR成功检测了ERBB2基因在不同组织的表达差异 在乳腺癌组织中 ERBB2的表达量是正常水平的1 8倍 实时荧光定量PCR法SYBRGreenI法举例 利用SYBRGreen1进行GMO定量 SGI forGMOsoydetection SYBRGreenI法GMO概念 转基因生物又称遗传修饰生物 GeneticallyModifiedOrganisms GMO 是经基因工程技术改变基因组构成的生物 包括转基因植物 转基因微生物和转基因动物 SYBRGreenI法GMO概念 1983年 首例转基因植物 转基因烟草1986年 转基因植物首次进入田间实验1994年 首例转基因植物产品 FlavrSavr延熟保鲜转基因番茄进入市场1996年 至今 转基因作物迅猛发展期 SYBRGreenI法检测方法 转基因生物包括了特异的核酸序列 调控序列 目标基因 报告基因通过内源基因来对每个样品DNA进行定量 Normalization 利用插入基因的定量来进行GMO含量检测 SYBRGreenI法材料准备 RoundupReady大豆 RTC公司 IRMM 41050 56 普通非转基因大豆从超级市场买来的下列食物用来作为测试样品 大豆饼 豆制甜点和两个牌子的大豆粉 SYBRGreenI法样品制备 标准品的制备 转基因成分含量分别为0 0 1 0 5 1 2 和5 转基因大豆实验样本 从含大豆成分的样本中提取DNA SYBRGreenI法引物设计 Lectin扩增片段长度为318bp其引物为 正向 5 GAC GCT ATT GTG ACC TCC TC 3 反向 5 GAA AGT GTC AAG CTT AAC AGC GAC G 3 EPSPS扩增片段长度为356bp其引物为 正向 5 TGG CGC CCA AAG CTT GCA TGG C 3 反向 5 CCC CAA GTT CCT AAA TCT TCA AGT 3 SYBRGreenI法 C t 定量 logA B logA logBA EPSPSGMOB LectinallbeanA B GMO SYBRGreenI法测GMO数据收集与分析 标准曲线log GMO对应 C t 获得熔解曲线分析 检测扩增产物 数据处理 C t EPSPS C t lectin C t 处理条件 假定两对引物有相同的扩增效率并且相互独立扩增 SYBRGreenI法测GMO熔解曲线分析 Tm 92oC Tm 88 5oC SYBRGreenI法测GMO实验结果1 标准曲线 不同转基因成分含量与Ctepsps做标准曲线 Cp4 epsps SYBRGreenI法测GMO实验结果2 样品的扩增曲线 SYBRGreenI法测GMO实验结果 定量分析 SYBRGreenI法测GMO实验结果定量分析 Calculate C t C t epsps C t lectin SYBRGreenI法测GMO实验结果标准曲线生成 根据 C t 值与标准品百分含量做标准曲线 SY