免疫组化方法(冰冻切片).docx

精品文档免疫组化方法（冰冻切片）A.所需溶液和试剂1. 二甲苯2. 无水乙醇（100% 和 95%，变性无水乙醇，组织学级）3. 苏木精（可选）4. 固定剂：请参考产品说明书选取合适的固定剂。a. 10%中性福尔马林b. 丙酮c. 甲醇d. 3%甲醛溶液：配制时，将18.75 ml 16%甲醛溶液加入到81.25 ml 1X PBS中。5. 10X Tris缓冲盐水（10X TBS）：在800 ml蒸馏水中加入24.2 g 三羟甲基氨基甲烷（Trizma base ，C4H11NO3）和80 g 氯化钠（NaCl）。用浓盐酸将pH调节到7.6。6. 漂洗（缓冲）液：1 X Tris缓冲盐水（TBS）。100 ml 10 X TBS加900 ml水至1L。7. 甲醇/过氧化氢：配制时，将10 ml 30% H202加入到90 ml甲醇中。保存在-20C。8. 封闭液：1X TBS / 0.3% Triton-X 100 / 5%正常山羊血清。9. 配制时，将500 l山羊血清和30 l Triton-X 100加入到9.5 ml 1X TBS中。10. 检测系统：根据厂家说明书使用。已有的检测系统*。11. DAB试剂或合适的底物：按产品说明配制。B.切片1. 对于保存在-80C的样品：切片前先从冰箱中取出放在-20C平衡15分钟左右。这可以避免切片时样品断裂。2. 将样品切成大约6-8 m厚，铺在带正电性的玻片上。3. 固定前，可以把切片摊开放在实验台上风干几分钟。（这有助于切片贴紧玻片）C.固定注意：参考产品说明书（抗体）选择合适的固定剂1. 玻片上的切片风干后，选用如下合适的固定剂进行固定。a. 10%中性福尔马林：室温10分钟。立即进行染色操作。b. 冰丙酮：-20C 10分钟。风干。立即进行染色操作。c. 甲醇：-20C 10分钟。立即进行染色操作。d. 3%甲醛溶液：室温15分钟。立即进行染色操作。e. 3%甲醛/甲醇：先在室温下3%甲醛中固定15分钟，然后在-20C的甲醇中固定5分钟（中间不漂洗）。立即进行染色操作。D.染色1. 切片用漂洗液洗两次，每次5分钟。2. 室温下，浸泡在3% H202/甲醇中孵育10分钟3. 用漂洗液洗两次，每次5分钟。4. 在切片上滴加封闭液，室温封闭1小时。5. 按抗体说明书的推荐比例将抗体稀释在封闭液中。6. 去掉切片上的封闭液，每个切片上加100-400 l稀释的一抗。4C孵育过夜。7. 去掉抗体。用漂洗液洗3次，每次5分钟。8. 根据厂家说明书，用合适的检测系统*检测。9. 用漂洗液洗3次，每次5分钟。10. 加入100400 l DAB或合适的底物，近距离检测染色进展。11. 一旦切片染色成功，立刻将玻片浸入水中。12. 如有需要，将切片泡在苏木精溶液中复染，按照产品说明进行。13. 切片用蒸馏水洗两次，每次5分钟。14. 切片脱水：a. 在95%乙醇中孵育两次，每次10秒。b. 在100%乙醇中孵育两次，每次10秒。c. 在二甲苯中孵育两次，每次10秒。