RP-HPLC法测定逍遥妇乐颗粒中栀子苷、芍药苷的含量.doc

RP-HPLC法测定逍遥妇乐颗粒中栀子苷、芍药苷的含量【关键词】 RP-HPLC 【摘要】 目的 用RP-HPLC法测定逍遥妇乐颗粒中栀子苷、芍药苷的含量。 方法 用UV确定栀子苷、芍药苷的检测波长为236nm，采用Metachem C-18柱（4.6mm250mm、5m），乙腈-0.02%磷酸（W/V）（15:85）为流动相，流速为1.0ml/min，=236nm，柱温为30。 结果 栀子苷在0.0971.552g范围内具有良好的线性（r 2 =0.9998），平均回收率为96.80%（RSD=1.9%），芍药苷在0.132.0g范围内具有良好线性（r 2 =0.9998），其平均回收率为100.28%（RSD=1.4%），n=9。 结论 此方法简便、准确，专属性强，为逍遥妇乐颗粒的质量控制提供了科学有效的方法。 【关键词】 RP-HPLC法 栀子苷 芍药苷 逍遥妇乐颗粒是老中医治疗胸痹的临床经验方，具有疏肝解郁、健脾利湿的功效，用于治疗肝郁化热、脾虚湿盛所致的妇女经前期紧张综合征。本方由白芍、牡丹皮、栀子等数10味中药经提取加工制成，组方较为复杂。为保证药品的内在质量，制定了芍药苷、栀子苷的含量测定方法，并进行相关方法学研究，认为线性、重复性、回收率、精密度等均较理想。 1 仪器与试药 Agilent1100系列高效液相色谱仪G1312A（Biupump）二元泵、G1313（ALS）自动进样器G1316A（COLOM）柱温箱G1314A（VWD）及Agilent工作站;UV-可见紫外分光光度计（SHIMADZU）;乙腈为色谱纯，其余均为分析纯;对照品芍药苷（paeoniflorin）、栀子苷（geniposide）购于中国药品生物制品检定所;样品逍遥妇乐颗粒（批号:010208）由本厂提供。 2 方法的研究 2.1 测定波长的确定 经紫外测定，栀子苷的最大吸收为238nm;芍药苷的最大吸收为230nm，二条吸收曲线相交吸收约为236nm，在此波长处，二种对照品的吸收都比较大，满足含量测定要求，故确定以236nm作为栀子苷和芍药苷的共同吸收波长。 2.2 流动相的选择 根椐文献报导及中国药典采用的流动相，比较了（1）甲醇异丙醇（67:4）0.05mol/L磷酸二氢钾醋酯（177:4）（28:72）;（2）乙腈0.1%磷酸（13:87）;（3）乙腈0.02%磷酸（W/V）（15:85），并设定柱温为30。根据上述三种流动相的试验结果，认为流动相（3）较理想。为此将“色谱条件与系统适应性试验”调整为用十八烷基硅烷键合硅胶为填充剂的色谱柱;乙腈0.02%磷酸（W/V）（15:85）为流动相;流速为1.0ml;检测波长:236nm;柱温30。理论板数按栀子苷峰、芍药苷峰计算应不低于6000。色谱图见图1、2。 图1 芍药苷、栀子苷对照品色谱 图2 逍遥妇乐颗粒样品图 2.3 提取方法选择 经查阅相关资料，用本品批号为010208的样品，对提取方法、提取溶剂、溶剂用量、提取时间进行考察，采用正交表L 9 （3 4 ）进行试验，由试验结果知，因素D提取时间影响小，作为误差项进行方差分析。见表14。 表1 逍遥妇乐颗粒含量测定法正交试验的因素（略） 表2 逍遥妇乐颗粒含量测定法正交试验的计算（略） 表3 逍遥颗粒中栀子苷正交试验的方差分析（略） 表4 逍遥颗粒中芍药苷正交试验的方差分析（略） 从对栀子苷、芍药苷进行正交试验的方差分析得知，提取溶剂与提取方法对栀子苷和芍药苷的提取率都有显著的影响，提取时间的长短对二者均无影响，溶剂的用量对栀子苷、芍药苷几乎没有什么影响，即采用样品的10倍量溶剂与20倍量溶剂提取，差别不大，为此最佳的提取方案为:采用50%的甲醇，加入样品10倍量的溶剂，回流20min。按此条件，又对同一批样品进行复核试验，根据复核试验的结果，栀子苷的平均含量为0.441%，比正交试验中的最大值0.407%提高8.3%，芍药苷的平均含量为0.533%，比正交试验中的最大值0.529%提高0.8%。由此证明所选最佳 方案是正确的。 2.4 标准曲线、定量限及检测限测定 将对照品栀子苷、芍药苷配制成不同浓度的溶液，以峰面积对浓度作图，栀子苷回归曲线为y=14307x+8.622，R 2 =0.9998，在0.0971.552g范围内具有良好的线性;芍药苷回归曲线为y=12483x+8.7132，R 2 =0.9998，在0.132.0g范围内具有良好的线性。芍药苷定量限为0.2g/ml、检测限为0.06g/ml;栀子苷定量限为0.17g/ml、检测限为0.05g/ml。 2.5 对照品溶液及供试品溶液的制备 2.5.1 对照品溶液的配制 取经真空干燥24h的对照品栀子苷10mg、芍药苷12.5mg，精密称定，分别置50ml量瓶中，加50%甲醇使溶解，并稀释至刻度，摇匀备用。分别精密吸取上述对照品溶液2ml，置10ml量瓶中，加50%甲醇稀释至刻度，摇匀，制成每1ml分别含栀子苷0.04mg、芍药苷0.05mg的溶液作为对照品溶液。 2.5.2 供试品溶液的制备 取本品装量差异项下的内容物，研细，取0.25g，精密称定，于100ml蒸馏瓶中，精密加入50%甲醇25ml，称定重量，水浴回流20min，冷至室温，称定重量，补足减失的重量，放置后，取上清液，以微孔滤膜（0.45m）滤过，取续滤液作为供试品溶液。 2.5.3 测定法 分别精密吸取对照品溶液与供试品溶液各10l，注入液相色谱仪，测定，待芍药苷的峰显示后约3min，梯度洗脱，调整为乙腈-0.02%磷酸（W/V）（80:20）洗脱5min，以洗去制剂中的杂质，再恢复原流动相，共约25min，即得。 2.6 重复性试验 取批号为020508的样品，按上述方法，制备6份样品，按法测定，栀子苷平均含量为0.377%，RSD为2.4%，芍药苷平均含量为0.529%，RSD为0.6%。 2.7 回收率试验 取批号为020508的样品，精密称定9份，加入高、中、低三种不同浓度对照品（即取栀子苷浓度为0.1552mg/ml、芍药苷浓度为0.2084mg/ml的对照品溶液，分别加入3ml、2.5ml、2ml），按上述方法制成3种不同浓度的供试品溶液，按法测定。见表5。 表5 回收率实验结果试验 （略） 2.8 精密度和稳定性试验 取批号为010208的样品0.25g，精密称定，按法制成供试品溶液，同法测定6次，栀子苷RSD为0.99%;芍药苷的RSD为1.06%。取同一样品分别在0、0.5、1、2、4、24h测定，栀子苷的RSD为2.3%，芍药苷的RSD为1.1%，说明该二种成分在制剂中提取后较为稳定。 2.9 样品测定 取批号为010208、010218、010225的3批逍遥妇乐颗粒样品，分别进行测定，结果见表6。由上述结果可知，此含量测定方法可运用于逍遥妇乐颗粒中栀子苷和芍药苷的含量测定。 表6 样品测定表（略