HPLC仪器原理20080610.ppt

HPLC仪器原理 大连依利特分析仪器有限公司应用实验室 主要内容 1 概述2 高压输液系统3 进样系统4 检测器5 色谱柱6 数据处理系统7 其他 1 概述 HPLC HighPerformanceLiquidChromatography 系统一般由输液泵 进样器 色谱柱 检测器 数据处理系统等组成 其中输液泵 色谱柱 检测器是关键部件 有的仪器还有梯度洗脱装置 在线脱气机 自动进样器 预柱或保护柱 柱温控制器 自动馏分收集装置 工作站等 高效液相色谱法的基本流程 2 高压输液系统 2 1高压输液泵 功能 高压输液泵是液相色谱分离过程的动力装置 它将冲洗剂 流动相 连续不断地送进柱系统 使样品在色谱柱中完成分离过程 2 2高压输液泵的基本要求 恒流 准确度与精密度恒压耐高压系统死体积小惰性表面压力检测与保护功能耐用 易维护程序控制 什么样的高压输液泵才是优良的呢 2 3泵的分类 柱塞往复泵 液压隔膜泵 螺旋注射泵 气动放大泵 世界主要HPLC仪器公司商品泵类型分布隔膜泵2 气动放大泵3 柱塞往复泵4 螺旋注射泵 2 4双柱塞往复泵结构 并联式双柱塞泵 串联式双柱塞泵 2 5消除脉动的方法 降低单冲程排液体积凸轮曲线设计改进驱动方式脉动阻尼器 2 6单向阀 柱塞杆和密封圈 单向阀 密封圈 柱塞杆 2 7部分P型高压恒流泵的技术指标 P230高压恒流泵 双柱塞串联式 P230p高压恒流泵 双柱塞串联式 P270高压恒流泵 双柱塞并联式 流量范围选择宽 可选择微量 分析 制备 稳定 重现 小结 3 进样系统 3 1功能与特点 功能 进样系统是将待分析样品引入色谱柱的装置 特点 进样重复性好死体积小耐高压保证中心进样便于实现自动化 3 2分类 手动手动注射进样器手动进样阀自动圆盘式坐标式其他 六通进样阀 可靠和重复自动注射样品自动完成进样 清洗和编程自动稀释 混合 衍生温度控制生物兼容 3 3AS230自动进样器 小结 4 检测器 连续监测色谱柱分离组分的组成和含量 4 1HPLC检测器基本要求 灵敏度高 线性范围宽 通用响应快 响应值不受温度及流动相影响噪音低 漂移小死体积小对样品无破坏性方便便宜 示差折光检测器RI紫外 可见 二极管阵列检测器DAD荧光检测器电化学检测器蒸发光散射检测器联用技术 LC MS LC MS MSLC NMR LC NMR MS 4 2常用HPLC检测器类型 商品HPLC检测器基本状况电化学2 荧光3 二极管阵列4 示差折光5 UV vis6 放射性7 LC MS8 LC FTIR 单波长及可变波长紫外 可见检测器光路图 4 3紫外 可见检测器 朗伯 比尔定律 紫外 可见检测池结构 UV230 紫外可见检测器 UV230 检测器特性 宽范围测定波长集成微型光学系统和二极管阵列技术光谱分辨率高 动态范围宽波长准确度和重复性高长寿命D2灯与W灯兼容生物HPLC系统 UV230 检测器功能 开机自检 电源 灯状态与能量 标准灵敏度时间波长程序高灵敏度吸收谱错误信息提示 UV230 检测器技术指标 波长范围 190nm 720nm波长分辨率 6nm波长准确度 0 5nm波长重复性 0 1nm时间波长程序 0 1min 999 9min响应时间设定 0 0sec 9 9sec 基线噪声 3 0X10 5 AU 基线漂移 5X10 4 AU h 反相标样 UV230 波长程序 苏丹红 UV230 波长程序 流通池的选择 分析池光程 10mm 体积 10 L半制备池光程 3mm 体积 5 L微量池光程 3mm 体积 1 2 L 4 4二极管阵列检测器 DAD DAD230二极管阵列检测器是大连依利特分析仪器有限公司在国家科技部 九五 攻关项目的支持下 开发的具有自主知识产权的高性能检测器 EC2000DAD数据处理工作站特点 等高线 光谱 色谱图 三维图 旋转与局部放大三维图 单波长 双波长吸收比 波长时间程序 最大吸收波长 总体吸收色谱图 色谱工作站所有定性定量功能色谱峰纯度判断 等高线图法 光谱色谱三维图法 重叠光谱图法 波长比图法和色谱峰纯度计算法等 谱图库管理与检索程序 建立特定的紫外谱图库 自动从光谱 色谱三维数据中对各色谱峰提取光谱图 自动谱图库检索 梯度控制 低压 高压 依利特DAD记录三维光 色谱图 等高线图1苯 2联苯 3萘 4蒽 5萤蒽 其中b的2 3之间有二甲苯 总体性能检测器浓度敏感性检测器中等灵敏度对压力和温度的变化很敏感流动相流速影响检测信号 流通池的几何形状 大小及材料 检测器的光路系统 4 5示差折光检测器 通用型检测器 示差折光检测器检测池示意图 依利特RI230示差折光检测器 4 6蒸发光散射检测器 有望作为新一代通用型检测器 蒸发光散射检测器的优点及限制 优点通用型质量检测器灵敏度高于RI可以进行梯度洗脱可作为SEC和SFC色谱 细内径LC检测器可测定磷脂 皂甙 糖类 聚合物 树脂限制受样品组分和流动相的挥发性的影响 ChromachemELSD检测器 4 6其它检测器 荧光检测器 激光诱导荧光检测器电化学检测器联用技术 LC MS LC MS MSLC NMR LC NMR MS LIFD230激光诱导荧光检测器 激发光波长 nm 473发射光中心波长 nm 525 510 540 激光类型10mWDPSS激光473nm 主要特点 全新的光路系统模块 采用共聚焦光学配置 减小了雷利散射和拉曼散射所引起的背景噪声 在发射通路上以长通滤光片及带通滤光片配合使用 以消减进入光电倍增管的激光散射 提高检测器的信噪比 对聚光物镜的数值孔径进行优化 以使物镜的工作距离和其聚光能力相匹配 采用大数值孔径的物镜 增加了物镜的采光效率 专用型检测池模块 采用反射式Z 型检测池 实现了荧光的高效采集 大大提高了LIFD的灵敏度 专用型激光器电源模块 小结 测得出来 尽量灵敏 多用途 5 色谱柱 色谱柱是HPLC分离过程的核心 1 柱头螺丝2 过滤筛板3 色谱柱管刃环4 柱头压帽5 色谱柱柱管 零死体积连接 3微米多孔二氧化硅微球 不同品牌填料性能参数比较 分析 制备 固定相颗粒粒径使用情况调查 实际应用中HPLC色谱固定相类型 柱重复性公司信誉柱寿命技术支持塔板数柱硬件设计产品资料其他 选择HPLC柱优先考虑的因素 小粒径短柱快速色谱制备柱整体柱专用色谱柱 蛋白质 肽 氨基酸 核酸 糖 手性 高通量柱 开发新药和组合化学 样品制备处理柱高光洁度柱管 内衬玻璃 PEEK 色谱柱发展方向 内径80mm柱长250mm填料 SinoChromODS BP粒度 20微米最大上样量 2g 俊杰制备色谱柱 6 数据处理系统 什么是工作站 由一台个人电脑为中心 实现色谱信号数据采集及处理 并实时控制色谱仪各部件的运行 从而形成闭环的控制系统 称色谱工作站 色谱工作站的基本功能 包含色谱积分仪的全部功能仪器控制功能计算机软件平台所提供的功能 GPC DAD 7 其他 7 1LU230低压梯度混合器 特点采用四入一出高质量快速响应电磁阀 保证流动相组成的准确性和稳定性 单片机计算扣除电磁阀启动时间 使得流动相组成变化步长减少到0 1 提高了流动相比例精度 并且有效降低了流动相切换周期 保证流动相均匀稳定 基于流动相流速参数控制电磁阀切换速度设定功能 保证在较高和较低流速下流动相分配的准确性 同时延长了电磁阀寿命 泵后静态混合器使溶剂混合快速 均匀 保证了分析结果的重现性 同时降低了基线噪声 计算机控制和面板设置2 4元低压梯度 实时显示各通道比例 可选择内置DG230在线脱气机 减小了仪器组合体积 7 2脱气机 依利特DG230在线脱气机 脱气机原理图 Teflon AF聚合物中空纤维脱气膜 7 3柱温箱