再谈同位素标记在高中生物学中的应用.doc

再谈同位素标记在高中生物学中的应用生物组 潘俊霞 2010年江苏省卷生物试题单科第28题考了一道关于有丝分裂的题。细胞周期包括分裂间期（分为G1期、S期和G2期）和分裂期（M期）。下图标注了甲动物（体细胞染色体数为12）肠上皮细胞的细胞周期各阶段的时长及DNA含量。请回答下列问题：（1）若用含放射性同位素的胸苷（DNA复制的原料之一）短期培养甲动物上皮细胞后，处于S期的细胞都会被标记。洗脱含放射性同位素的胸苷，用无放射性的新鲜培养液培养，定期检测。预计最快约 h后会检测到被标记的细胞。（G2期时长：2.2h）（2）从被标记M期细胞开始出现到其所占M期细胞总数的比例达到最大值时，所经历的时间为 期的时间。（M期：1.8h）上述题中用的是同位素标记方法来检测时间的长短，下面再谈一下同位素（或同位素示踪技术）在高中生物学的应用。同位素示踪技术是研究生物学实验的一项重要技术。同位素示踪技术实验的创建者是Hevesy.Hevesy于1923年首先用天然放射性212Pb研究铅盐在豆科植物体的分布和转移。同位素示踪所利用的放射性核素（或稳定性核素）及它们的化合物，与自然界存在的普遍元素及其化合物的化学性质和生物学性质是相同的，只是具有不同的核物理性质。利用放射性同位素不断放出特征射性的核物理性质，就可以用核探测器追踪它在体内或体外的位置、数量及其转变。稳定性同位素虽不释放射性，但可以利用它与普通相应同位素的质量之间，用一定的仪器也可以测定。在高中生物所涉及的实验中上述两种同位素都有用到。1、用放射性同位素3H标识亮氨酸研究蛋白质的合成过程。新课标（人教版）必修1在资料分析中介绍了科学家研究蛋白质的合成过程。帕拉德及其同事把用放射性同位素3H标记的亮氨酸注入到豚鼠的胰腺腺泡细胞中，发现3min后被3H标记的亮氨酸出现在内质网中；17min后出现在高尔基体中；117min后，出现在靠近细胞膜内侧的运输蛋白质的囊泡中，以及释放剂细胞外的分泌物中，由此可以看出，分泌蛋白最先由内质网上的核糖体形成，然后转移到内质网加工，再通过出芽方式形成囊泡，到高尔基体进一步加工，最后通过细胞膜的胞吐作用运输到细胞外。从而也证明了生物膜在结构和功能的联系性。2. 利用放射性同位素标记14C研究C元素（或CO2）在光合作用中转移途径以及光合作用的产物。2.1 20世纪50年代，M.Calvin等人利用放射性核素14C标记14CO2失踪实验中发现，在加入14CO2几秒后，就有14C-3-磷酸甘油酸的积累，随后又出现在六碳糖缩合成的淀粉中。在放射性核素实验中证明，CO2首先在核酮糖1，5-二磷酸羧化酶催化下，CO2同核酮糖1,5-二磷酸（RuBp一种C5化合物）结合生成2分子的3-磷酸甘油酸（14C3化合物）。随后，3-磷酸甘油酸消耗光反应产生的ATP，生成1-3-二磷酸甘油酸，1-3二磷酸甘油酸接受光反应产生了六碳糖和更为复杂的化合物。结果显示，六碳化合物的六个碳原子都带有14C标记，由于上述过程中，CO2与C5结合首先生成了一种C3化合物，因此叫C3循环也叫卡尔文循环。2.2 C4植物的发现20世纪60年代，澳大利亚M.D.Hatch和C.R.Slack发现有些热带植物如甘蔗、玉米除了和其他植物一样具有卡尔文循环外，还有一条固定CO2的途径，即C4途径，它和卡尔文循环联系在一起。C4途径是14CO2首先与植物体内一种C3化合物磷酸希醇式丙酮酸在磷酸希醇式丙酮酸羧化酶催化下生成一种合四个碳原子的化合物草酰乙酸。所以这个反应途径称四碳双羧酸途径，亦称C4光合碳同化，也称为Hatch-Slack途径。2.3 探究光合作用的产物2.3.1 长期以来，糖类曾被认为是光合作用的唯一产物，而其它物质是再度合成的(如蛋白质、脂肪和有机酸)，是植物利用糖再度合成的。的确，这些物质一部分是再度合成的，但有些是光合作用的直接产物。科学家利用14CO2供给小球藻，在未产生糖之间，就发现有放射性的氨基酸（如丙氨酸、甘氨酸）和有机酸（如丙酮酸、苹果酸）出现。以14C-醋酸供给离体的叶绿体，光照后，14C进入叶绿体中某些脂肪酸（如棕榈酸、油酸和亚油酸）中。由此可见，蛋白质、脂肪和有机酸也都是光合作用的直接产物。2.3.2 光合作用的产物O2是来自H2O还是CO2？1939年，美国科学家鲁宾和卡门利用稳定性同位素，标记进行了探究。他们用同位素18O分别标记H218O和C18O2，然后进行了两组实验：第一组向植物提供提供H2O和C18O2，第二组向同种植物提供，H2O和CO2。在其他条件都相同的情况下，他们分析了两组实验释放的O2，结果标明，第一组释放的O2全部是O2，第二组释放的O2全部是18O2，这一实验有力证明光合作用释放的O2来自水。但时间长了，第一组中有18O2，第二组中有O2出现，因为细胞呼吸中，O2和H2O是循环利用的。3用放射性同位素示踪技术可以研究有丝分裂过程中物质的合成和细胞周期各个时期的长短。3.1 一个完整的细胞周期可以划分为间期和分裂期，间期分为G1期（主要进行RNA复制和有关蛋白质的合成）、S期（主要进行DNA复制）和G2期（继续合成RNA和蛋白质）。细胞分裂的间期要为分裂期做好物质的准备工作。科学家用放射性同位素3H分别标记胸苷和尿苷，结果发现，3H-胸苷的大量利用在S期，而3H-尿苷的大量利用则发生在G1期和G2期，胸苷是合成DNA的原料，而尿苷是形成RNA的原料，由此标明DNA的复制发生在S期，而转录则主要发生在G1和G2，同时要形成大量的蛋白质。3.2 研究细胞周期各个时期的长短脉冲标记DNA复制和细胞分裂指数观察测定法，这种方法适用于细胞种类构成相对简单，细胞周期时间相对较短，运行均匀的细胞群体。用放射性3H-TdR的培养液短期培养细胞，经过短暂培养后，将3H-TdR洗脱，用新鲜培养液继续培养。就3H-TdR培养后，凡是处于S期的细胞均被标记。培养液，被标记的S期细胞陆续进入M期（分裂期），最先进入M期的标记细胞是被标记的S期最晚期细胞。所以从培养液开始，到被标记的M期细胞开始出现为止，所经历的时间为G2期时间（T G2）,从标记的M期细胞开始出现到其所占M期细胞总数的比值达到最大值（100%），所经历的时间为M期时间（TM）,从被标记的M期细胞总数占M期细胞总数的50%开始经历最大值，到下降到50%所经历的时间为S期时间（TS），从被标记的M期细胞开始出现并逐渐消失，到被标记的M期细胞再次时间为一个细胞周期（TC）, TC减去T G2，TM、TS则剩余时间为T G1。4、噬菌体侵染大肠杆菌实验，用32P标记T2-噬菌体的DNA，用35S标记蛋白质外壳分子，探究T2-噬菌体的遗传物质。1952年，赫尔希和蔡斯以T2-噬菌体为实验材料，用同位素标记技术探究了T2-噬菌体的遗传物质的本质。T2-噬菌体是一种专门寄生在大肠杆菌体内的病毒，它的头部和尾部外壳是由蛋白质构成的，头部内含有DNA。T2-噬菌体侵染大肠杆菌后，就会在自身遗传物质的作用下，利用大肠杆菌体内的物质合成自身的组成成分，进行大量增殖。当噬菌体增殖到一定数量后，大肠杆菌裂解，释放出大量的噬菌体。赫尔希和蔡斯首先分别含有放射性同位素35S和放射性同位素32P的培养基中培养大肠杆菌，再用上述大肠杆菌培养T2噬菌体，得到DNA含有32P标记或蛋白质含有35S标记的噬菌体。然后用32P或35S标记的T2噬菌体分别侵染未被标记的大肠杆菌，经过短暂保温后，用搅拌器搅拌离心。离心后，检测上清液和沉淀物中的放射性物质发现：用35S标记的一组感染实验，放射性同位素主要分布在上清液中，用32P标记的一组实验，放射性主要分布在试管的沉淀。这个结果表明：T2噬菌体的蛋白质外壳没有进入到大肠杆菌，进入大肠杆菌的是T2噬菌体的DNA。进一步观察发现：细菌裂解放出的噬菌体中，可以检测到32P标记的DNA，但却检测不到35S标记的蛋白质。由此可以表明，子代噬菌体的各种性状是通过亲代的DNA遗传的。DNA才是遗传物质。5.DNA分子复制1958年，M.Meselson和F.stahl用15N标记大肠杆菌3个世代的DNA,证明DNA复制为半保留复制，15N是14N的放射性核素，比14N重些，将大肠杆菌放到15N的培养基上培养多代，其DNA分子都是标记上了15N放射性核素。15N-DNA的比重大于14N-DNA的比重。经氯化铯密度梯度离心后，这两种DNA在离心管中沉淀位置不同。重的DNA要靠近底部。由于DNA分子吸收紫外线，因此，采用紫外线照像可以记录下DNA在离心管中部位。DNA离心后，结果发现：细胞分裂一次后，DNA分子条带出现的位置上有一条，在离心液的中部，底部没有DNA条带，而细胞分裂两次后，出现了两条DNA条带，一条在中部，一条在上部。分析可知：假如DNA复制方式为全保留复制，分裂第一次，离心后应有两条条带，一条带在底部（15N-DNA分子），另一条在上部14N-DNA，而结果却只有一条中部条带，此DNA分子应该一条链为15N链，一条链为14N，第二次分裂以后，出现中部一条带15N14N-DNA，而另一条带在上部14N-DNA，没有底部15N 15N-DNA，由此可以知道，DNA复制方式不是全保留复制，而是半保留复制。6.DNA复制的半不连续复制DNA复制时，两条链都作为复制的模板，DNA双螺旋的两条链为反向平行。因此在复制叉解开的DNA链，一股是5-3方向，另一股是3-5方向，两个模板的极性不同，但DNA聚合酶都是按5-3方向催化DNA合成，那么作为复制模板的那股5-3的亲本链，其子链复制又将如何？1968年冈崎提出了DNA复制的半不连续性复制模型。他用3H脱氧胸苷短期标记大肠杆菌，提取DNA并经变性，再用超离心法得到了一些8-10s的小片段，当延长标记时间，这些片段可变为成熟的DNA链。冈崎认为，在合成DNA时，首先合成小片段的DNA，由这些小片段再连接形成长链DNA。7. 利用放射性同位素42K、32P标记无机盐离子，研究矿质元素运输途径和有机物运输途径。7.1 把柳茎一般的韧皮部同木质部分离开来，在两者之间插入或不插入不透水的蜡纸。在柳树根施予42K，5h后测定42K在柳茎各部分的分布。试验得知，有蜡纸间隔开的木质部含有大量42K，而韧皮部几乎没有42K，这说明根部吸收的放射性钾是通过木质部上升的。在分离以上或以下部分，以及不插入蜡纸的实验中，韧皮部都有较多的42K。这个现象表明42K从木质部活跃地横向运输到韧皮部。利用放射性同位素32P研究叶片吸收离子后向下运输的途径。把棉花一段的韧皮部和木质部分开，其间插入蜡纸，叶片施用32PO42-，1h后测定32P的分布。试验结果表明，磷酸被叶片吸收后，是沿韧皮部向下运输的；同样磷酸盐也从韧皮部横向运输到木质部，不过，从叶片的下行运输的还是以韧皮部为主。叶片吸收离子在茎部向上运输的途径也是韧皮部，不过有些矿质元素能从韧皮部横向运输到木质部而向上运输。所以，叶片吸收的矿质元素在茎部向上运输是通过韧皮部和木质部。矿质元素在植物体内运输速度为30-100cm/h。7.2 用放射性同位素14CO2及KH232PO4分别施于天竺葵茎上下端两侧的叶片上，并将中间茎部的一段树皮与木质部分开，隔以蜡纸。经过12-18h光合作用后，测定各段的14C和32P放射性，结果发现韧皮部各段皆含有相当数量的14C和32P。由此可见，有机物在植物体上行和下行运输都通过韧皮部。同化产物也可以以横向运输，但正常状态下其量甚微，只有当纵向运输受阻时，横向运输才加强。8.利用放射性同位素131I作为示踪元素来研究甲状腺。人体甲状腺的工作需要碘，碘被吸收后会聚集在甲状腺内，用以合成甲状腺激素。给人注射碘的放射性同位素131I，之后定时用探测器测量甲状腺及邻近组织的放射性，有助于诊断甲状腺的器质性和功能性疾病。9.利用放射性同位素作为示踪元素标记DNA分子，作为基因探针用放射性同位素标记DNA分子作为基因探针，利用DNA分子杂交原理，检测被标测细胞或标本的遗传信息。在基因工程中要检测生物染色体DNA上是否插入了目的基因，就可以用含有目的基因或特定的DNA片段用放射性同位素标记，以此作为探针，使探针与待检测的基因组DNA杂交，如果显示杂交带，就表明有要检测的基因存在。如果还需要检测基因是否表达，