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饲料加工方式对发酵过程中离赖氨酸微生物降解的影响原著：Nuria Canibe, Bent Borg Jensen 译者：张兰兰 刘 洁 校者：程宗佳摘 要 本研究旨在探讨饲料加工方式对液体饲料在发酵过程中游离赖氨酸的微生物降解的影响。在生长期仔猪的基础日粮中添加游离氨基酸，试验分为两个处理：处理1 将饲料制粒(83 ) ；处理2 将饲料粉碎未加热。饲料与水混合(12.75，w / w )，约25培养。在饲料与水混合的瞬间，粉料中的肠杆菌数量比颗粒饲料高，但发酵几个小时后，这两种加工饲料中细菌的数量相似。粉料中的乙酸含量比颗粒饲料高。发酵时，粉料中游离赖氨酸的降解率高于颗粒饲料。这是通过一个更有实力的FLF 系统( 实行回喷几天后) 特别观测的。结论：数据显示，发酵时未制粒未加热的饲料中游离赖氨酸降解率高，而颗粒饲料中的游离赖氨酸在发酵时只发生了有限的降解。1 前言 已证实，给猪饲喂发酵液体饲料可改善肠道健康(Boesen 等,2004;Canibe和Jensen,2003;Lindecrona 等,2003)。然而，在液体饲料发酵过程中，游离赖氨酸可能被微生物降解(Pedersen,2001;Niven 等,2006;Canibe 等,2007)，从而影响动物的生长。研究表明，大肠菌群能降解游离赖氨酸(Niven 等,2006)，但并未阐明是否涉及其他微生物。现在对于影响液态饲料发酵过程中游离赖氨酸降解的因素还不清楚。饲料热处理会降低饲料中微生物的数量，制粒会影响饲料基质的结构。可以认为这些因素都会对发酵过程产生影响，从而对发酵混合物的特性产生影响。本实验室针对液体饲料的加工方式是否对发酵过程中游离赖氨酸的微生物降解产生影响展开了研究。2 材料与方法2.1 饲料 在丹麦生长期仔猪标准日粮中添加赖氨酸2.0g / k g，蛋氨酸2.0g /k g，苏氨酸2.5g / kg，日粮组成为：大麦49.51% ；小麦20.00% ；脱皮烘烤豆粕23.68%，动物脂肪2.00% ；糖蜜1.00% ；碳酸钙0.91 ；磷酸氢钙0.84% ；氯化钠0.36% ；L - 赖氨酸-40 0.5% ；苏氨酸-50 0.5% ；DL- 蛋氨酸-40 0.5% ；维生素和矿物质预混料0.20%。一半饲料制粒，83加热，另一半粉碎。2.2 试验步骤 饲料和水混合的比例为2.75 1，将混合物放在一个1 升容积的生物反应器中，25培养。每个处理测定2 个重复。4 个生物反应器，2 个盛放粉碎饲料混合物，2 个装有颗粒饲料混合物。在样品培养的48h 期间，没有减少或添加饲料或水。培养0h，6h，24h 和48h 后分别取出一个样品。培养48h 后，90的混合物被取出，然后添加等量新配的新鲜饲料和水( 回喷溅)，培养到72h，96h 和120h 时采用相同程序。120h 实行回喷溅后，分别在120h，126h，132h，144h 和150h 取一个样品。第一个48h 的培养模拟的是一个新设定的F L F 系统，回喷溅后最后几个小时，模拟的是一个已在运行F L F 的系统，即处于稳定状态。2.3 分析方法 短链脂肪酸、乳酸和琥珀酸的含量采用J e n s e n 等(1995) 的方法进行测定，并进行了一些修改。微生物计数是将液体饲料样品(10g ) 转移到含蛋白胨水90m L 的烧瓶中，每升蛋白胨水中含10.0g 细菌培养蛋白胨( 默克1.07213, D a r m s t a d t , 德国) 和吐温801.0g，再将悬浮液转移到一个塑料袋内，搅拌2m in。然后，按照M i l l e r 和W o l i n (1974) 的方法将蛋白胨水10 倍稀释，将样品放在选择性培养基上。20厌氧培养3d 后，在MRS琼脂对乳酸菌计数( 默克1.10660)。37有氧培养1d 后，在M c C o n k e y琼脂上对肠杆菌计数( 默克1.05465)。20有氧培养3d 后，在麦芽氯霉素/ 氯四环素MCA 琼脂上对酵母菌和霉菌计数，MCA 琼脂含有葡萄糖( 默克1.08337)10g / L、麦芽提取物( 默克1.05397)3g / L，酵母提取物( 默克1.03753)3g / L、细菌培养蛋白胨( 默克1.07224)5g / L、氯四环素、氯霉素(SR0177E，Oxoid 有限公司，Basingstoke，Hampshire，英格兰) 各50mg/L、琼脂( 默克1.01614)15g / L。用C a n i b e 等(2007) 的方法来测定游离赖氨酸和生物胺的浓度。3 结果两种加工方式的饲料培养到48h 时，pH 值从5.9 下降到4.24.4， 从120h 150h，pH 值均在5.4 3.8 的范围内( 图1a)。两种处理的乳酸细菌计数基本相同，0 时初始值都是3log cfu/g，培养48h 后为9.2 9.5log cfu/g，培养120h 到150h 时为8.8 9.9( 图1b)。0 时粉料的肠杆菌数量为4.9log cfu/g，高于颗粒料(3.2log cfu/g)，但在培养24h 后，两种料型均达到相似的峰值( 图1c)。培养48h 后，肠杆菌数量再次下降至2.5log cfu/g 3log cfu/g，培养132h 后，即回喷溅12h 后，任何样品中均未检测到肠杆菌( 检测水平2log cfu/g)。培养48 小时后酵母数量达到5.2log cfu/g 5.8log cfu/g，用FLF 计数，即培养到120h 和150h 时，酵母数量在5.0log cfu/g 6.3log cfu/g 之间波动，粉料中的酵母数量稍微高一些( 图1d)。培养期间，粉料中乙酸浓度高于颗粒料。培养48h 后，颗粒料中乙酸浓度为24m m o l / kg，粉料中含乙酸51mmol/kg，培养150h 后，颗粒料中的乙酸浓度是35m m o l / k g，粉料中含乙酸50mmol/kg( 图2a)。培养24h 后粉料中乳酸浓度高于颗粒料，但培养144h 和150h 后， 粉料中乳酸浓度低于颗粒料( 图2b)。培养24h 后，粉料中游离赖氨酸的消失率高于颗粒料( 图3a )，培养48h 后，粉料中游离氨基酸的消失率为74，颗粒料中的是25。在研究的第二个阶段，也就是说回喷溅后，两种料型游离赖氨酸的含量差异更加显著。培养120h 150h 时，颗粒料中游离赖氨酸基本不受影响，而培养144h 后粉料中却基本检测不出游离赖氨酸。培养48h 后，颗粒料干物质中尸胺的浓度为263m g / k g，而粉料干物质中为1044m g / k g，回喷溅后，处理间的差异又很明显，颗粒料干物质中尸胺含量最高值18m g /k g， 而粉料中在132h 时就达到1045m g / k g，到150h 时达到最高值1364mg/kg。4 讨论目前的数据清楚地说明了液态饲料发酵过程中游离赖氨酸被降解的问题，有趣的是，他们还显示出饲料的加工方式对这种降解有很大的影响。一些学者测定了液态饲料在发酵过程中游离赖氨酸的消失率(Pedersen，2001 ；Niven 等，2006 ；Canibe 等，2007)。Niven 等(2006)对未接种液态饲料培养初期的赖氨酸含量和接种103 大肠杆菌/ m L 的液态饲料中赖氨酸含量进行比较后，得出赖氨酸的消失和尸胺的产生是由于大肠杆菌的代谢。C a n i be 等( 未发表) 在对未接种液态饲料和分别接种103/ g、105/ g、107/ g 大肠杆菌后的液态饲料中赖氨酸含量进行对比后得到同样的结果。不过，研究也表明，回喷溅后，也就是建立了一个更稳定的系统后，大肠杆菌对游离赖氨酸含量的影响非常有限。这些结果表明，一旦内源微生物区系在F L F 上建立起来，添加外源大肠杆菌则不会再破坏这个系统。在本研究中，由于颗粒料经过加热起到杀菌作用，所以当新鲜料与水混合后，粉料中含有较高的肠杆菌(0h 和120h )。经过几个小时后，这两个处理中的数值相似。关于乳酸菌，两处理之间没有差异，粉料中酵母含量数量稍微多一些，但双重测定的变异较大。因此，本研究还未得出存在的微生物与游离赖氨酸降解的关系。另一方面，有关乙酸和乳酸浓度的数据差异表明不同处理间存在微生物的活性和/ 或组成差异显著。通过体外研究初步表明，发酵过程中，未制粒未加热饲料中游离赖氨酸降解率较高，而经过制粒和加热的饲料则降解较少。产生这些结果的机理以及两种处理对微生物种类的影响还有待于进一步研究。并且通过利益冲突分析发现两种处理没有利益冲突。参考文献：1 Boesen,H.T.,Jensen,T.K.,Schmidt,A.S.,Jensen,B.B.,Jensen, S.M.,M ller,K.,2004.The influence of diet on Lawsoniaintracellularis colonization in pig supon experimental challenge.Vet.Microbiol.103,35 45.2 Canibe,N.,Jensen,B.B.,2003.Fermented and non-fermented liquid feed to growing pigs: effect on aspects ofgastrointestinal ecology and growth performance.J.Anim.Sci.81,2019 2031.3 Canibe,N.,Virtanen,E.,Jensen,B.B.,2007.Microbial and nutritional characteristics of pig liquid feed duringfermentation.Anim.Feed Sci.Technol.134 (1 2),108 123.4 Jensen,M.T.,Cox,R.P.,Jensen, B.B.,1995.Microbial production of skatole in the hind gut of pigs given different dietsand its relation to skatole deposition in backfat.Anim.Sci.61,293 304.5 Lindecrona,R.H.,Jensen,T.K.,Jensen,B.B.,Leser,T.D.,Jiufeng,W.,M ller,K.,2003.The influence of diet on thedevelopment of swine dysentery upon experimental infection. Anim.Sci.76,81 87.6 Miller,T.L.,Wolin,M.J.,1974.A serum bottle modification of the Hungate technique for cultivating obligate anaerobes.Appl.Microbiol.27,985 987.7 Niven,S.J.,