病毒性疾病标本采集、保存与检测.ppt

病毒性疾病标本采集 保存与检测中国疾控中心病毒病所王世文 采样前准备包括各种采样现场需要的器械 耗材 无菌标本容器 采样后处理试剂 低温保存设备和个人防护装备 以及各种采样表格等 明确采样要求针对不同事件的处置 采样目的 对象 标本种类各不相同 采样人员需要根据事件或疫情的特点 制定出详细的 有针对性的采样工作程序 内容主要包括 采样目的 对象 时间 部位 标本量 无菌要求 一般不需要 标本保存与运输条件等 并需根据现场实际情况进行必要的调整 现场采样 标本采集应严格按照相关生物安全规定进行保护医务和疾控人员 现场采样 血标本 血清需采集多份血清标本至少急性期 发病7d内或发现时 恢复期 与急性期间隔2 3周 分别采集外周静脉血各5ml 6ml 分离后的血清分装于3个塑料螺口血清管中一份0 5ml左右 用于即将开始的检测一份检测备份一份留存 监测病种 现场采样 呼吸道标本上呼吸道标本 包括咽拭子 鼻拭子 鼻咽抽取物 咽漱液 痰液下呼吸道标本 包括呼吸道抽取物 支气管灌洗液 胸水 肺组织活检标本消化道标本患者的粪便和肛拭子要求 发病早期即开始采集 根据病程决定采集的频次 采好的标本分装于3个螺口塑料试管中 现场采样培训 现场采样 其它人体标本包括脑脊液 疱疹液 淋巴结穿刺液等采集好的标本分装于3个螺口塑料试管中 尸体解剖不明原因疾病的死亡病例尽可能采集死亡病例的所有组织器官应根据疾病的临床表现 采集与疾病有关的重点组织器官标本 如肺 肝穿刺 做病原学研究的组织标本采集得越早越好 疑似病毒性疾病的标本采集时间最好不超过死后6h病理检查的标本不超过24h同种组织每一部位至少采集3份标本 1份用于病原学研究 无菌采集 1份用于病理学研究 固定于福尔马林中 1份用于电镜检查 固定于电镜标本保存液中 重要的组织器官应多部位同时采集标本 现场采样 媒介和动物标本疑似虫媒传染病或动物源性传染病 现场采样 现场采样 做好样品标记样品标记非常关键 是所有标本辨识的唯一标志 绝对不能出现任何错误标本采集过程中 应保证采样记录表登记 采样日志记录与样品标记同时进行 并确保编号一一对应样品编号需要在标本容器表面与容器盖顶上同时进行标记 避免容器与盖子错配 造成标本的交叉污染 发热伴血小板减少综合征监测 采集标本血清血凝块血浆白细胞 背景 2004年以来 浙江 安徽 江苏 山东 河南 湖北等省相继报告一些以发热伴血小板减少为主要表现的感染性疾病病例 其中少数重症患者可因多脏器衰竭损害 救治无效死亡2004年 浙江 安徽等省局部地区发现发热 血小板减少散发病例 实际发病数不详 病因不明2005年5月 江苏报告发热 血小板减少散发病例 实际发病数不详 病因不明2005年9月 湖北省咸宁市报告6例聚集性不明原因发热病例 首发病例死亡 5为续发病例为首发病例的亲属 发病前均有在护理首发病例过程中接触首发病例呕出血液史 该起疫情也未能明确病原 背景 2006年11月 安徽省广德县报告10例聚集性发热伴血小板减少的病例 首发病例死亡 诊断为 疑似流行性出血热 在其诊疗和护理的医务人员和家属接触者中出现9例病例 其中医务人员4例 家属5例 续发病例具有首发患者呕出血液和其他分泌物暴露史 经检测确诊为嗜吞噬细胞无形体病 这是我国首次确认人粒细胞无形体病此后山东 安徽 河南等省也相继有疑似无形体病报告 ZhangLijuan etal JAMA2008 300 19 2263 2270 背景 2007年3 9月 河南省信阳市及其周边地区共报告79例疑似无形体病病例 死亡10例 针对该起疫情的病原学检测未能做出明确结论2009年3 10月 湖北随州 黄冈等6个市共报告疑似无形体病病例93例 6例死亡 其中随州58例 黄冈18例 经实验室检测 嗜吞噬细胞无形体均为阴性 1例病例查菲埃里克体阳性 背景 疾病特点多为急性起病 多数患者伴有乏力 纳差 恶心 呕吐 腹痛 腹泻等症状 部分患者出现黑便 牙龈出血 皮肤瘀点或瘀斑 眼结膜充血等出血症状 绝大多数患者白血病不高或降低 血小板减少 部分患者谷丙 谷草转氨酶升高 尿蛋白阳性 病例均发生在丘陵地区 发病时间集中在5 10月 男性多于女性 且多为农民 20岁以下及80岁以上人群未见发病 背景 病毒细菌立克次体埃里克体无形体 发热伴血小板减少综合征监测 采集标本血清血凝块血浆白细胞 标本保存 血清可在4 存放3d 20 以下长期保存 用于病毒等病原分离和核酸检测的标本应尽快进行检测24h内能检测的标本可置于4 保存 24h内无法检测的标本则应置于 70 或以下保存 标本运送 要严格做到生物安全依据病因分析的病原体分类 如果为高致病性病原微生物 应严格按照 病原微生物实验室生物安全管理条例 国务院424号令 和 可感染人类的高致病性病原微生物菌 毒 种或样本运输管理规定 中华人民共和国卫生部第45号令 人间传染的病原微生物名录 等有关规定执行 标本检测与解释 标本的预处理血清灭活病毒性疾病的实验室检测方法可分为三类 即直接检测 间接检测和血清学检测 标本检测与解释 直接检测直接检测临床标本中病毒颗粒 病毒抗原或病毒核酸方法电镜 免疫电镜检测 组织中包涵体检查 IFA ELISA检测抗原 病毒核酸 基因组检测等特点一般在标本采集 送达的当天或次日就可得到结果 这对于需要根据实验室检测结果进行临床处置和尽早采取防控措施极为重要 但对标本的要求也较高 病变部位标本的阳性结果比其它部位的阳性结果诊断意义大得多 标本检测与解释 标本检测与解释 抗原检测常用方法免疫荧光试验 IF 双抗体夹心ELISA法等IF优点 快速 易于操作缺点 敏感性和特异性较低IF试验对标本质量的要求较高由于在结果判定时有一定主观性 需要检测人员具有较丰富的经验双抗体夹心ELISA法比IF复杂 但敏感性和特异性较高 标本检测与解释 核酸检测已经成为病毒性疾病实验室诊断中最常用的方法 发挥着越来越重要的作用 核酸检测的方法多种多样 主要包括两类不进行病毒核酸扩增的探针杂交法核酸扩增的方法 PCR RT PCR Real timePCR 基于核酸序列的扩增 如NASBA 标本检测与解释 特点敏感性极高 简便 快速 Real timePCR还可以定量检测高通量 多病原快速检测 标本检测与解释 间接检测 病毒分离细胞培养原代细胞培养传代细胞培养鸡胚接种尿囊腔卵黄囊 动物接种 标本检测与解释 血清学检测在病毒学实验室中使用最为普遍 如急性期血清中特异性IgM IgA IgG检测等血清学检测的方法多种多样 多数病毒性感染通常都可以采用血清学检测的方法加以诊断双抗原夹心ELISA法 间接ELISA 单扩溶血试验 SRH 中和试验 NT IgM抗体捕捉ELISA法 免疫层析法等 标本检测与解释 IgM抗体捕捉ELISA法和免疫层析法主要用于血清中IgM的检测IFA 双抗原夹心ELISA法 间接ELISA和单扩溶血试验 SRH 用于检测血清中全抗体 IgG 中和抗体 四倍及四倍以上增高 标本检测与解释 NT在一些病毒难于分离的病毒性疾病实验室检测中 成为实验室确诊的 金标准 标本检测与解释 病毒性疾病的实验室检测绝非通过一种检测方法就能够解决 一般都是通过两种或两种以上检测共同完成的质控SOP先进方法与传统方法传统方法的改良 平阴县人民医院 PingyinPeople sHospital 平阴县中医院 PingyinTraditionalChineseMedicineHospital 文登市妇幼保健院 WendengMaternityandChildCareServiceCenter 文登市中心医院 WendengCentralHospital 文登开发区医院 WendengDevelopmentzoneHospital 唾液样品质量控制SalivaSampleQualityControl 对855份唾液样品进行RNasePPCR检测 占已检测样品总数的25 08 855 3409 其中阴性5份 占0 58 5 855 有效样本达到99 42 850 855 DBS样品质量控制DBSSampleQualityControl 对724份DBS样品进行RNasePPCR检测 占已检测样品总数的22 04 724 3285 其中阴性1份 占0 14 1 724 有效样本达到99 86 723 724 平阴县人民医院 PingyinPeople sHospital 平阴县中医院 PingyinTraditionalChineseMedicineHospital 文登市妇幼保健院 WendengMaternityandChild