微生物学实验指导.doc

常用培养基的配制、分装和灭菌一、实验目的了解细菌、放线菌、真菌通用培养基制作的一般方法和操作步骤。了解微生物培养基的原理。二、实验内容1. 牛肉膏蛋白陈培养基的配制。2高氏1 号培养基的配制。3PDA培养基的配制。三、实验材料和用具牛肉膏、蛋白胨、琼脂、可溶性淀粉、葡萄糖、马铃薯、1mol/L NaOH、lmol/LHCl、KNO3、NaCl、K2HPO43H2O、MgSO47H2O、FeSO47H2O。试管、三角瓶、烧杯、量筒、玻璃棒、天平、牛角匙、pH 试纸、棉花、牛皮纸、记号笔、线绳、纱布、漏斗、漏斗架、胶管、止水夹等。四、操作步骤（一）牛肉膏蛋白胨培养基的配制牛肉膏蛋白胨培养基是培养异养细菌最常用的是牛肉膏蛋白胨培养基，为天然培养基。牛肉膏是牛肉浸液的浓缩物，含有丰富的营养物质，不仅为微生物提供碳源、氮源，还含有多种维生素。蛋白胨是酪蛋白、大豆蛋白、鱼粉等经蛋白酶水解后的中间产物，含有、胨和氨基酸等丰富的含氮素营养物，因此能完全满足大多数异养细菌对营养的需要。其配方如下：牛肉膏3g，蛋白胨10 g，Nacl 5 g，琼脂1520 g，水1000 mL，pH 7.47.61称药品 按实际用量计算后，按配方称取各种药品放入大烧杯中。牛肉膏可放在小烧杯或表面皿中称量，用热水溶解后倒入大烧杯；也可放在称量纸上称量，随后放入热水中，牛肉膏使与称量纸分离，立即取出纸片。蛋白胨极易吸潮，故称量时要迅速。2加热溶解 在烧杯中加入少于所需要的水量，然后放在石棉网上，小火加热，并用玻棒搅拌，待药品完全溶解后再补充水分至所需量。若配制试管斜面固体培养基，则将称好的琼脂放入己溶解的药品中，再加热融化，此过程中，需不断搅拌，以防琼脂糊底或溢出，最后补足所失的水分。若是在平皿中制成平板固体培养基，则将称好的琼脂放入三角瓶中，放入高压灭菌锅灭菌，灭好菌后再倒入平皿。3 调pH 检测培养基的pH，若pH 偏酸，可滴加l mol/LNaOH，边加边搅拌，并随时用pH 试纸检测，直至达到所需pH 范围。若偏碱，则用l mol/L HCl 进行调节。pH 的调节通常放在加琼脂之前。应注意pH 值不要调过头，以免回调而影响培养基内各离子的浓度。4过滤 液体培养基可用滤纸过滤，固体培养基可用4 层纱布趁热过滤，以利培养的观察。但是供一般使用的培养基，这步可省略。5分装 按实验要求，可将配制的培养基分装入三角瓶内。做试管斜面分装入试管时，将已煮好的培养基趁热分装于试管中，分装装置可用带铁环和漏斗的分装架，分装时，试管垂直桌面，注意不要使培养基残留在试管口附近，以免污染。一般培养基装量为试管长度的1/51/4，塞上乳胶塞。分装量：固体培养基约为试管高度的l/5，灭菌后制成斜面。分装入三角瓶内以不超过其容积的一半为宜。6加试管塞 试管口和三角瓶口塞上试管塞。7包扎 加塞后，将三角瓶的棉塞外包一层牛皮纸或双层报纸，以防灭菌时冷凝水沾湿试管塞。若培养基分装于试管中，则应以5 支或7 支在一起，再于棉塞外包一层牛皮纸，用绳扎好。然后用记号笔注明、培养基名称、组别、日期。8灭菌 将上述培养基于121.0湿热灭菌20min。如因特殊情况不能及时灭菌，则应放入冰箱内暂存。9摆斜面 灭菌后，如制斜面，则需趁热将试管口端搁在一根长木条上，并调整斜度，使之自然冷却，凝固成斜面，斜面的长度约为试管长的1/2，斜面摆好后，在培养基凝固以前，不宜再移动。10无菌检查 将灭菌的培养基放入37温箱中培养24 h48 h，无菌生长即可使用，或贮存于冰箱或清洁的橱内，备用。（二）高氏l 号培养基的配制高氏1 号培养基是用于分离和培养放线菌的合成培养基。其配方如下：可溶性淀粉20 g，KNO3 1g，NaCl 0.5g，K2HPO43H2O 0.5g，MgSO47H2O 0.5g，FeSO47H2O 0.01g，琼脂1520g，水1000 mL，pH 7.47.6。l称量和溶解 先计算后称量，按用量先称取可溶性淀粉，放入小烧杯中，并用少量冷水将其调成糊状，再加至少于所需水量的水，继续加热，边加热边搅拌，至其完全溶解。再加入其他成分依次溶解。对微量成分FeSO47H2O 可先配成高浓度的贮备液后再加入，方法是先在1000mL 中加入1g 的FeSO47H2O，配成浓度为0.01g/mL 的贮备液，再在1000 mL培养基中加入以上贮备液1mL 即可。待所有药品完全溶解后，补充水分到所需的总体积。如要配制固体培养基，其琼脂溶解过程同牛肉膏蛋白胨培养基配制。2pH 调节、分装、包扎及无菌检查 同牛肉膏蛋白胨培养基配制。（三）PDA培养基的配制PDA培养基是用于培养真菌常用的培养基，其配方如下：马铃薯200 g，葡萄糖20 g，水1000 mL，pH自然。1配制：将去皮的马铃薯切成小块，加水1000毫升，煮沸1520分钟，用四层纱布过滤，取其滤液，加入琼脂用文火使其溶化（若使用琼脂条可先剪成小段，煮琼脂时要多搅拌，直至完全溶化），最后补足水分至1000 mL。搅拌均匀。2pH 调节、分装、包扎及无菌检查 同牛肉膏蛋白胨培养基配制。倒平板的方法：右手持盛培养基的试管或三角瓶置火焰旁边，用左手将试管塞或瓶塞轻轻地拨出，试管或瓶口保持对着火焰；然后左手拿培养皿并将皿盖在火焰附近打开一缝，迅速倒人培养基约15 mL，加盖后轻轻摇动培养皿，使培养基均匀分布在培养皿底部，然后平置于桌面上，待凝后即为平板。 五、注意事项称药品用的牛角匙不要混用，称完药品应及时盖紧瓶盖。调pH 时要小心操作，避免回调。不同培养基各有配制特点，要注意具体操作。六、实验报告记录本实验配制培养基的名称、数量，指明要点。本组做了高氏1 号培养基30个要点：溶解药品时，一定要变加热边溶解；还有，溶解淀粉时，用少量水溶解，然后在加大量水。七、问题和思考l配制培养基有哪几个步骤? 培养基中加琼脂的作用是什么？琼脂融化要注意什么？配置培养基的步骤：计算称量溶化调节pH分装加棉塞包扎灭菌搁置斜面 加琼脂的作用：充当固化剂，起支持作用。琼脂融化注意：温度不能太高也不能太低；受热均匀；加热完后，在合适的温度倒平板，防止凝固。2培养基配制完成后，为什么必须立即灭菌?若不能及时灭菌应如何处理?已灭菌的培养基如何进行无菌检查?很明显，培养基里含有丰富的氮源，碳源，微量元素等等。如果不立即灭菌，那么，就会长菌。你可能会认为再灭菌不就可以了？！但是，很多的微生物，特别是真核微生物在生长的时候会改变溶液的PH，同时灭菌后细胞破碎，带入新的氨基酸，蛋白等，这些都是试验不稳定的因素。如果不能立刻灭菌，应该在配置培养基的时候直接称取粉末，不加入水溶解，可在室温保存。如果加入的是液体的，已经配置好的培养基，应该在4度并保存，但时间不宜过长。已经灭菌的培养基灭菌时残留有生命力的孢子或在贮存时有可能被杂菌污染，所以在使用该培养基时要进行无菌检查 通常是放在37的恒温箱中一两天后 培养基上没有生长任何微生物的就可以使用（若有微生物则是以菌落出现的 肉眼可以看见的）土壤中微生物的分离、纯化微生物的纯培养一、实验目的了解微生物分离和纯化的原理；掌握常用的分离纯化微生物的方法。 二、实验原理 从混杂微生物群体中获得只含有某一种或某一株微生物的过程称为微生物分离与纯化。平板分离法普遍用于微生物的分离与纯化。其基本原理是选择适合于待分离微生物的生长条件，如营养成分、酸碱度、温度和氧等要求,或加入某种抑制剂造成只利于该微生物生长，而抑制其他微生物生长的环境，从而淘汰一些不需要的微生物。微生物在固体培养基上生长形成的单个菌落，通常是由一个细胞繁殖而成的集合体。因此可通过挑取单菌落而获得一种纯培养。获取单个菌落的方法可通过稀释涂布平板或平板划线等技术完成。值得指出的是，从微生物群体中经分离生长在平板上的单个菌落并不一定保证是纯培养。因此，纯培养的确定除观察其菌落特征外，还要结合显微镜检测个体形态特征后才能确定，有些微生物的纯培养要经过一系列分离与纯化过程和多种特征鉴定才能得到。 土壤是微生物生活的大本营，它所含微生物无论是数量还是种类都是极其丰富的。因此土壤是微生物多样性的重要场所，是发掘微生物资源的重要基地，可以从中分离、纯化得到许多有价值的菌株。三、实验器材3.1 培养基 淀粉琼脂培养基(高氏I号培养基)，牛肉膏蛋白胨琼脂培养基，PDA培养基。 3.2 溶液或试剂 盛9ml无菌水的试管，盛90ml无菌水并带有玻璃珠的三角烧瓶。 3.3 仪器或其它用具 无菌玻璃涂棒，无菌吸管，接种环，无菌培养皿，土样，显微镜。四、实验步骤4.1 稀释涂布平板法 1取土壤 取表层以下510cm 处的土样，放入无菌的袋中备用，或放在4冰箱中暂存。2制备稀释液(要无菌操作)(1)制备土壤悬液：称土样0.5g，迅速倒入带玻璃珠的 49.5 mL 无菌水瓶中(玻璃珠用量以充满瓶底力最好)，振荡510 min，使土样充分打散，即成为10-2的土壤悬液。(2)稀释：用无菌移液管吸10-2 的土壤悬液0.5 mL，放入4.5 mL 无菌水中即为10-3 稀释液，如此重复，可依次制成10-310-8 的稀释液。注意：操作时管尖不能接触液面，每一个稀释度换用一支移液管，每次吸入土液后，要将移液管插入液面，吹吸3 次，每次吸上的液面要高于前一次，以减少稀释中的误差。3. 混菌法测定菌落数的方法(1)细菌：取10-7、10-6 、10-5三管稀释液各1mL，分别接入相应标号的平皿中，每个稀释度接两个平皿。然后取冷却至50的牛肉膏琼脂培养基，分别倒入以上培养皿中(装量以铺满皿底高1.52mm 为宜)，迅速轻轻摇动平皿，使菌液与培养基充分混匀，但不沾湿皿的边缘，待琼脂凝固即成细菌平板。倒平板时要注意无菌操作。（2）放线菌：分别取10-5、10-4 、10-3三管稀释液1mL 加入相应标号的平皿中，选用高氏1 号培养基，用与细菌相同的方法倒入平皿中，便可制成放线菌平板。（3）霉菌：取10-2、10-3 、10-4两管稀释各1mL，分别接入相应标号的平皿中，每个稀释度接两个平皿。选用融化的PDA培养基中，轻轻摇匀，然后用与细菌相同的方法倒入平皿中，便可制成霉菌的平板。4培养 将接种好的细菌、放线菌、霉菌平板倒置，即皿盖朝下放置，于2830中恒温培养，细菌培养12d，放线菌培养57d，霉菌培养35d。观察生长的菌落，用于进一步纯化分离或直接转接斜面。4.2 平板划线分离法 1. 倒平板 按稀释涂布平板法倒平板，并用记号笔标明培养基名称、土样编号和 划线。在近火焰处，左手拿皿底，右手拿接种环，挑取上述10-l的土壤悬液一环在平板上划线(图4-3)。划线的方法很多，但无论采用哪种方法，其目的都是通过划线将样品在平板上进行稀释，使之形成单个菌落。用接种环以无菌操作挑取土壤悬液一环，先在平板培养基的一边作第一次平行划线34条，再转动培养皿约70度角，并将接种环上剩余物烧掉，待冷却后通过第一次划线部分作第二次平行划线，再用同样的方法通过第二次划线部分作第三次划线和通过第三次平行划线部分作第四次平行划线。划线完毕后，盖上培养皿盖，倒置于温室培养。 2.挑菌落 同稀释涂布平板法，一直到分离的微生物认为纯化为止 4.3 继续划线分离获得纯培养将培养后长出的单个菌落分别挑取少许细胞，采用划线的方法接种到上述三种培养基斜面上，分别置28和37温室培养，进行分离、纯化，获得纯培养。现有杂菌，需再一次进行分离、纯化，直到获得纯培养。（1） 倒平板 按稀释涂布平板法倒平板，并用记号笔标明培养基名称、土样编号和 划线。在近火焰处，左手拿皿底，右手拿接种环，挑取上述10-l的土壤悬液一环在平板上划线(图4-3)。划线的方法很多，但无论采用哪种方法，其目的都是通过划线将样品在平板上进行稀释，使之形成单个菌落。用接种环以无菌操作挑取土壤悬液一环，先在平板培养基的一边作第一次平行划线34条，再转动培养皿约70度角，并将接种环上剩余物烧掉，待冷却后通过第一次划线部分作第二次平行划线，再用同样的方法通过第二次划线部分作第三次划线和通过第三次平行划线部分作第四次平行划线。划线完毕后，盖上培养皿盖，倒置于温室培养。 （2） 挑菌落 同稀释涂布平板法，一直到分离的微生物认为纯化为止。 五、思考题：1. 所做涂布平板法和划线法是否较好地得到了单菌落？如果不是，请分析其原因并重做。所做涂布平板法和划线法没有较好地得到了单菌落。原因：接种环未冷却，导致细菌烫死；涂布的时候没涂开；接种环未彻底灭菌。2. 在三种不同的平板上你分离得到哪些类群的微生物？简述它们的菌落特征。细菌：比较小，表面或光滑粘稠，或粗糙干燥，易挑起放线菌：干燥，多皱，难挑起，菌落较小，多有色素霉菌：菌丝细长，菌落疏松，常呈绒毛状，有时还呈红黄黑等颜色革兰氏染色法及显微镜使用一、实验目的：学习细菌的简单染色法和革兰氏染色法。二、实验原理：用于生物染色的染料主要有碱性染料、酸性染料和中性染料三大类。碱性染料的离子带正电荷，能和带负电荷的物质结合。因细菌蛋白质等电点较低，当它生长于中性、碱性或弱酸性的溶液中时常带负电荷，所以通常采用碱性染料（如美蓝、结晶紫、碱性复红或孔雀绿等）使其着色。酸性染料的离子带负电荷，能与带正电荷的物质结合。当细菌分解糖类产酸使培养基pH下降时，细菌所带正电荷增加，因此易被伊红、酸性复红或刚果红等酸性染料着色。中性染料是前两者的结合物又称复合染料，如伊红美蓝、伊红天青等。简单染色法是只用一种染料使细菌着色以显示其形态，简单染色不能辨别细菌细胞的构造。革兰氏染色法是1884年由丹麦病理学家C.Gram所创立的。革兰氏染色法可将所有的细菌区分为革兰氏阳性菌（G+）和革兰氏阴性菌（G）两大类，是细菌学上最常用的鉴别染色法。该染色法所以能将细菌分为G+菌和G菌，是由这两类菌的细胞壁结构和成分的不同所决定的。G菌的细胞壁中含有较多易被乙醇溶解的类脂质，而且肽聚糖层较薄、交联度低，故用乙醇或丙酮脱色时溶解了类脂质，增加了细胞壁的通透性，使初染的结晶紫和碘的复合物易于渗出，结果细菌就被脱色，再经蕃红复染后就成红色。G+菌细胞壁中肽聚糖层厚且交联度高，类脂质含量少，经脱色剂处理后反而使肽聚糖层的孔径缩小，通透性降低，因此细菌仍保留初染时的颜色。三、实验器材1、活材料：培养12-16h的苏云金杆菌（Bacillus thuringiensis）或者枯草杆菌（Bacillus subtilis）；培养24小时的大肠杆菌（Escherichia coli）；前次实验从土壤中分离的细菌培养物。2、染色液和试剂：2.1 结晶紫溶液：结晶紫乙醇饱和溶液（取结晶紫约48g，溶于95%乙醇100ml中）20ml，1%草酸铵溶液80ml，将上述两溶液混合，过滤。静置48 h后使用。结晶紫不可用龙胆紫代替。前者是纯品，后者不是单一成分，易出假阳性。结晶紫溶液放置过久会产生沉淀，不能再用。2.2 卢哥氏碘液（Lugol） 碘片 1g ，碘化钾 2g ，蒸馏水 300 mL 先将KI溶解在少许水中，再将碘片溶解在碘化钾溶液中，充分振荡，待碘完全溶解后再加入其余的蒸馏水，定容。当溶液由棕黄色变为淡黄色时应弃去。为易于储备，可将上列碘与碘化钾溶于30ml蒸馏水中，配成10倍母液，使用用前稀释使用。2.3 脱色剂 95%乙醇2.4 番红复染剂 番红 2.5 g ，95%乙醇 100 mL取上述配好的番红酒精溶液10 mL与80 mL蒸馏水混匀即可使用。四、实验方法1 涂片 用镊子取出载玻片，在取两块载玻片各滴一小滴生理盐水于载玻片中央，分别用接种环挑取菌液涂布于生理盐水中，涂匀形成薄膜。（注意：接种环挑菌前后均应于酒精灯火焰上灼烧）。2干燥 室温中自然干燥。3固定：涂片面向上，于火焰上通过2-3次，以固定细胞形态。注意不能在火焰上烤，否则细菌形态将毁坏。4 初染 加1滴结晶紫染料，染色约1分钟，水洗至冲下之水无色为止。注意水流不应过急，过大，水由薄片上端流下，避免直接冲在涂片处。5 媒染 滴加碘液冲去残水，并覆盖1分钟左右，水洗。6脱色 将载玻片上的水甩净，衬以白背景，用95%的酒精洗至酒精刚刚不出现紫色时为止，大约20-30秒，立即用水冲净酒精。7 负染 用番红液染2-3分钟，水洗。晾干或用吸水纸吸干。8 镜检 显微镜观察 载玻片置于显微镜下观察。镜检。呈紫色者为革兰氏阳性菌，红色者为阴性菌。如用油镜观察的话，滴上一滴香柏油，将油镜浸在香柏油中观察。实验完毕后，显微镜上镜头及载玻片上的香柏油用擦镜纸粘上二甲苯擦干净。9 同样的方法挑取土壤中分离的菌落制片观察革兰氏反应。 注：革兰氏染色成功的关键在于严格掌握酒精脱色程度，脱色过度，阳性菌可被误染为阴性菌。脱色不够，阴性菌可误染为阳性菌。菌龄也影响染色结果，阳性菌培养时间过长，也常呈阴性反应。显微镜油浸系物镜的使用一、实验目的和内容目的：复习显微镜低倍镜和高倍镜的使用技术，了解油浸系物镜的基本原理，掌握油浸系物镜的使用方法。内容：1学习油浸系物镜的使用方法。2用油镜观察革兰氏染色装片。二、实验材料和用具枯草芽孢杆菌(Bacillus subitilis)、金黄色葡萄球菌(Staphylococcus aureus)的染色装片。香柏油、二甲苯、显微镜、擦镜纸。三、操作步骤(一)观察前的准备1将显微镜置于平稳的实验台上，镜座距实验台边沿约为4cm。坐正，练习用左眼观察。2调节光源：将低倍物镜转到工作位置，把光圈完全打开，聚光器升至与载物台相距约1mm 左右。转动反光镜采集光源，光线较强的天然光源宜用平面镜，光线较弱的天然光源或人工光源宜用凹面镜，对光至视野内均匀明亮为止。观察染色装片时，光线宜强；观察末染色装片时，光线不宜太强。(二)低倍镜观察染色装片首先上升镜简，将枯草芽孢杆菌染色装片置于载物台上，用标本夹夹住，将观察位置移至物镜正下方，物镜降至距装片0.5cm 处，适当缩小光圈然后两眼从目镜观察，转动粗调节器使物镜逐渐上升(或使镜台下降)至发现物像时，改用细调节器调节到物像清楚为止。移动装片，把合适的观察部位移至视野中心。(三)高倍镜观察眼睛离开目镜从侧面观察，旋转转换器，将高倍镜转至正下方，注意避免镜头与玻片相懂。再由目镜观察，仔细调节光圈，使光线的明亮度适宜。用细调节器校正焦距使物镜清晰为止。将最适宜观察部位移至视野中心，绘图。不要移动装片位置，