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蛋白质纯化技术ProteinPurificationTechniques 汤丽霞 电子科技大学 TextbookandReferences 教材 蛋白质纯化技术及应用陆健化学工业出版社参考书目 生物化学实验技术何忠效化学工业出版社生物化学技术原理及应用赵永芳科学出版社 Exams 平时成绩 10 出勤 作业 期末考试 50 对已学知识掌握和综合运用能力的考察 实验成绩 40 动手能力 实验报告 48学时包括 授课 16学时 实验 32学时 Outline ChapterIProteinIsolation蛋白质分离2学时ChapterIIPurificationTechniques纯化技术10学时ChapterIIIStrategiesforSpecialProteinPurification几类特殊蛋白质纯化策略4学时 Whydoproteinpurification Togaininsight 研究蛋白质结构与功能基础Foruseinmdicine Insulin 胰岛素 BloodFactorVIII hemophilia Glucoseoxidaseandperoxidae 葡萄糖检测 Foruseinindustry biocatalysis Howtodo Stop 来源 前期处理 纯化 蛋白质分离纯化过程 Ammoniumsulfatefractionation Organelle Homogenization Nucleic acid Carbohydrate Lipid Si ze Charge Polarity Affinity Smallmolecule Cell Debris Protein Aminoacid Sugar Nucleotides etc Gelfiltration SDS PAGE Ultrafiltration Ionexchange Chromatofocusing Disc PAGE Isoelectricfocusing Reversephase chromatography HIC Salting out Affinity chromatography Hydroxyapatite JuangRH 2004 BCbasics 材料选择与处理 粗分级 细分级 根据需求设定方案 Functionalstudies MassSpectroscopy Antigenforimmunization Structuralstudies pg ng g mg moderate 80 high 95 99 proteinamountrequired purityrequirement 尽量遵循以下原则 Asfewstepsaspossible 步骤尽量少 Asshortatimeaspossible 时间尽量短 LowTemperature tokeepactivity 保持活性 Purificationisatoughtask 1 生物材料的组成极其复杂 木瓜蛋白酶 papain Purificationisatoughtask 2 目的蛋白含量极微 只达万分之一 几十万分之一甚至百万分之一 蛋白质纯化好比爬山 材料选择及处理 细胞破碎及分离 ChapterI ProteinIsolation 1 1材料选择及处理 材料的来源 动物 植物和微生物选材的基本原则 有效成分含量高 稳定性好 来源丰富 易保鲜 提取工艺简单 成本低等 材料处理 动物组织要先除去结缔组织 脂肪等非活性部分 植物要先去壳 除脂 微生物材料要及时将菌体与发酵液分开 材料选取有效成分含量高的部分 主要存在于番木瓜的根 茎 叶和果实中 以未成熟的果实乳汁中含量最高 木瓜蛋白酶 体外重组表达 获取蛋白的主要来源之一 构建表达载体 1 2细胞破碎和提取 细胞破碎 Thefirststepinthepurificationofmostproteinsistodisrupttissuesandcellsinacontrolledfashion 细胞破碎方法 研磨法高速匀浆超声破碎法压榨冻融表面活性剂或脂溶性溶剂酶法 机械法 化学法 生物化学法 物理法 细胞破碎方法 研磨法 一种机械破碎细胞法适用于动物组织 细菌和植物加入石英砂或经液氮处理以提高效率 高速珠磨 细胞破碎方法 超声破碎法 借助超声波的振动力破碎细胞 适用于微生物材料 破碎效果与菌体浓度 超声频率以及时间有关 此法的缺点是在处理过程中会产生大量的热 细胞破碎方法 压榨法 压榨是一种温和的 彻底破碎细胞的方法 缺点是仪器费用较高 细胞破碎方法 化学法 脂溶性溶剂或SDS 十二烷基磺酸钠 等表面活性剂处理细胞 可将细胞膜溶解 从而使细胞破裂 Fractionation 分离 Centrifugationisthemostwidelyusedproceduretoseparatethehomogenateintodifferentparts orfractions 离心机 固定角转子 F M 2r 悬浮式转子 水平转子 沉降系数 sedimentationcoefficient 沉降系数 即生物大分子在离心力场的作用下 从静止状态到达极限速度所需要的时间 生物大分子在离心时 其分子量 密度 形状等均对其沉降速度有影响 沉降系数就是用来描述此沉降性质的 生物大分子沉降时间通常为1 200 10 13秒范围 S 10 13秒 ChapterI小结 对蛋白质纯化过程大概了解细胞破碎方法 重点 沉降系数 理解掌握 补充一 确定目标蛋白检测手段 DetectionandquantitationoftargetingproteinTheassayshouldbe Specific 专一Quantitative 定量Economicalintermsoftimeandmaterial 简便经济 补充二 Bufferpreparation 缓冲液配制 Buffersaresolutionsofweakacidsorbasesandtheirsalt s whichresistchangesinpH Bufferpreparation pKa值 该基团在此pH一半解离 缓冲液有效缓冲范围为PKa 1pH 以醋酸缓冲液为例 CH3COOH CH3COONa Bufferregion Q CouldtherequiredmixtureofCH3COOHandCH3COONabemadebytitratingasolutionofCH3COONatothecorrectpHwithHCl No acid base salt waterabuffer acid itssalt or base itssalt Q CouldtherequiredmixtureofCH3COOHandCH3COONabemadebytitratingasolutionofCH3COOHwithNaOH Yes Nobyproductproduced 没有副产物生成 常用缓冲液的pKa值 Tris 三羟甲基氨基甲烷 HEPES n 2 羟乙基哌嗪 n 2 乙磷酸 MOPS 3 n 吗啉代 丙磺酸 PIPES n n 双 2 乙磺酸 哌嗪 MES 2 n 吗啉代 乙磺酸 Addsomeothercomponentsincasetheyareneeded 添加必要的稳定剂 巯基的保护剂 DTT 巯基乙醇 添加金属离子络合剂 EDTA添加蛋白酶抑制剂 PMSF 苯甲基磺酰氟 抑制哺乳动物蛋白酶DFP 磷酸二异丙基