流式细胞术应用技巧.ppt

流式细胞仪应用技巧 金从国2009 11深圳 利用流式细胞仪 flowcytometer 通过检测荧光信号来检测细胞或其它颗粒性物质 表面或胞浆或胞核 的物理 化学特性并通过这些特性对细胞或颗粒进行定量 检测表面标记物 检测胞浆标记物 检测胞核内标记物 检测可溶性蛋白 流式细胞术 FLOWCYTOMETRY 一 流式细胞仪的原理 应用技巧的基础 1 仪器的基本原理 光源 激光 488nm氩离子空冷激光 细胞 单细胞悬液液流 鞘液 SheathFluid 流动室 FlowCell检测器 光电倍增管 PMT 检测信号 散射光 FS SS 荧光信号 FL1 FL4 统计分析 计算机 散射光信号FS细胞大小SS细胞颗粒性荧光信号FL1 FITCFL2 PEFL3 ECDFL4 PC5FL5 PC7 用荧光标记抗体 抗体特异性地结合细胞上对应的抗原 表达该抗原的细胞被标记上荧光 抗原表达多的细胞荧光强度强 阳性细胞百分比或浓度 靶蛋白浓度 2 标本处理原理 标记原理 1 直标和间标 2 细胞膜标和细胞内标 3 两种染色 抗体和染料 4 组合标记 间接免疫荧光标记法 直接免疫荧光标记法 抗原分布 Importantformethodoptimization 表面 胞浆 核内是共同检测还是分别检测 CD3 4 8 tetramer Cytokines CD3 4 8 tetramer DNA Cytokines DNA CD3 4 8 tetramer Cytokines DNA IntracellularCytokine Protocol 2 提供的信息 1 方案 两种图形 散点图 直方图 2 百分率信息 强度信息 3 分群 细胞大小 FS 细胞内颗粒 SS 4 设阈值 设门特征 细分 5 直接信息 间接信息 二 流式细胞仪的应用技巧一 整合项目 树立体系化概念 提高流式使用价值 白血病全过程评价 患者出现症状 各种抗原 参照白血病抗原选择原则 诊断白血病 确诊疾病 对白血病进行分型以指导治疗 治疗 初诊时所用抗原中能够代表白血病细胞的特殊抗原 评价疗效及治疗的疗程 同上 缓解期 动态跟踪患者缓解期的白血病细胞变化 及时控制在相应水平下 临床过程 FCM检测项目 意义 CIK细胞治疗过程的评价 治疗前病人免疫状况评价 T亚群 NK CIK 细胞因子 是否适合做 能否能培养 值得做CIK 采集MNC MNC数目 纯度 T亚群 NK CIK数目及比例 是否达到培养要求 调节细胞数 MNC数目 T亚群 NK CIK数目及比例 CD3 CD8活化状况 培养 培养是否达标 回输时机 回输后 T亚群 NK CIK 细胞因子 疗效评价 监测 下次治疗的时机 CIK治疗程序 FCM检测项目 意义 肿瘤细胞免疫特点 AIDS全过程免疫细胞评价 基础免疫水平 T亚群 NK CIK 当地不同年龄 性别 民族的免疫水平基础数据 高危人群 HIV检测阳性 T亚群 NK CIK CD4凋亡 细胞因子 HIV检测阳性前的免疫水平变化状况及CD4的凋亡 T亚群 NK CIK CD3 CD4 CD8活化状况 细胞因子 CD4凋亡 HIV阳性 AIDS 检出HIV到发病的情况 AIDS病人治疗 T亚群 NK CIK 细胞因子 CD4凋亡 CD3 CD4 CD8活化状况 疗效评价 监测 治疗效果及病情动态观察 AIDS过程 FCM检测项目 意义 骨髓移植或CD34细胞移植 动员 采集 PBSC的冻存 解冻和回输 回输后免疫功能的监测 并发症 三 流式细胞仪的应用技巧二 利用仪器的灵活性 充分整合项目 1 CIK细胞作用肿瘤细胞的凋亡分析2 不同细胞的转染 表达情况3 不同分型增殖的细胞分布4 sp细胞 非sp细胞 5 肿瘤细胞诊断时 1 胸腹水 把白细胞和癌细胞分开 2 穿刺 手术细胞 6 组织中的浸润细胞 7 Th1 Th2细胞的分析 四 流式细胞仪的应用技巧三 利用仪器提供的参数 对所做实验全面分析评价 1 质粒转染中 转染率疫苗转染的强度2 同时分析转染率和转染强度3 稀有细胞的额外发现 T亚期中 CD45 CD3 CD4 CD8 NK细胞 CD3 CD16 56 CD3 CD16 56 4 Tunecl方法中不同周期的凋亡状况细胞阻滞状况DNA断片发生时SOS状况 五 流式细胞仪的应用技巧四 了解相关知识及现有的评价方法 充分应用流式细胞 1 白血病分型形态学 免疫组化 PCR2 细胞因子生物活性测定法 RIA和ELISA法 DNA分析法外周血单个核细胞产生细胞因子检测法 FCM ELI SPOT FCM STAT 3 HLAB27 B7FCM 免疫法4 凋亡 蛋白表达FCM 免疫组化 PCR5 CIK DC CD34 CD44V CD31等 荧光显微镜下经丫啶橙 溴化乙啶染色 SGC 7901细胞24h SGC 7901蒿甲醚组24h SGC 7901DDP组24h ECV 304细胞24h ECV 304蒿甲醚组24h ECV 304DDP组24h 六 流式细胞仪的应用技巧五 专项应用中的问题及解决方案 免疫细胞相对绝对计数造血干细胞和其他稀有细胞的检测血小板活化 膜糖蛋白及抗体检测DNA倍体分析 周期 异倍体分析细胞内因子 Th1 Th2 细胞因子 体液及培养液因子 各种凋亡检测 Apo 2 7Tunecl DNA亚二倍体 组织中免疫细胞和其他细胞 如CXCR CCR 基因蛋白检测 如p53 Bcl 2等 白血病免疫分型B27检测动物检测过程中的问题 免疫细胞的检测 T细胞分群标志活化标志亚群标志B细胞NK细胞CIK细胞以T细胞亚群检测为例 其余的免疫细胞出现的问题类似 1 标准方案抗凝血组织胸腹水 灌洗液 单细胞悬液 加入1ml溶血素 NH4Cl或C液或A B C液 上机检测 结果 CD3 TCell AbsCD4 TCell AbsCD8 TCell Abs CD4 CD8比值 2hr内加入100ulFlowCount 100ul 份 10ul抗体标本标记15 30min 2 可能的问题及解决办法 1 标本环节抗凝血 A 抗凝效果不好 如果没有大的凝血块 该血可以使用 但结果可能受影响 设阈值时最好采用Fl1 CD45所在 如果有大的凝血块 不能用于检测 B 标本在4 或以下放置过 一般不做检测用 C 标本放置时间大于48小时 检测时尽量用Fl1设阈值 建议 最好使用新鲜标本检测 尤其是做绝对计数时 D 动物血 对于猪 猴 兔 狗等大动物的 如人一样处理 而如小白鼠等小动物 由于所采血量少 需要先溶血 后加样处理 如需做绝对计数 则要求计算稀释倍数 比如10ul血加入490ul溶血素相当于稀释了350倍 2 可能的问题及解决办法组织标本 组织标本做免疫细胞时 通常需要CD45设行 这样可排除非血细胞 A 组织标本通常不需要研磨 只需用针头反复捣碎便可 这样可以减少组织细胞的量 B 穿刺细胞 手术标本需要反复清洗表面附有的血液 否则会影响检测结果 C 组织标本一般保存在生理盐水中 2 可能的问题及解决办法胸腹水 灌洗液 通常也需要CD45设门A 都需要浓缩处理 一般取250ml左右 静置4hr后取沉淀物离心 B 如果需要计数 则需做体积换算 比如250ml 500ul 相当于浓缩了500倍 组织 胸腹水标本 希望做2次过滤 第一次为标记前 采用200目过滤 第二次为上机检测前 采用300目过滤 2 可能的问题及解决办法 2 抗体环节试剂选择A 尽量选择试剂组合多的作为标记抗体 比如T亚群CD45 CD4 CD3 CD8 最佳选择CD4 CD8 CD3 可用 但做起来会有很多麻烦单一抗体 不可用 2 可能的问题及解决办法B 选择试剂时 不但需要选择阳性标记 同时也需要选择阴性标记 比如 CD4T细胞 CD45 CD3 CD4 CD8 B细胞 CD19 CD3 NK细胞 CD3 CD16 56 CD34 细胞 CD34 CD38 尤其在科研项目中 一般应选择2 3个阳性标记 同时选择1 2个阴性标记 否则所做出来的结果将会有很大误差 2 可能的问题及解决办法C 在医学中 一般标记抗原较弱的 需选择较强的染料 尤其我们在做稀有细胞的时候 比如DC细胞 CD34细胞 CIK细胞 间充质干细胞等 一般均选择标记PE细胞 标记条件 一般18 25 如果温度低或高效果都不好标记时间 根据所用试剂量决定 一般不得低于15min 2 可能的问题及解决办法标记的先后顺序A 先标记膜表面的 后标记胞浆内B 先处理抗体 后加染料C 透膜处理后的标本不能强烈振荡 2 可能的问题及解决办法溶血环节溶血素的选择A AB液 主要是甲酸成分 一般需要专门的制备仪CB NH4Cl 主要成分是NH4Cl NH4HCO3 EDTA C 溶血素C 专配试剂 2 可能的问题及解决办法自配溶血素要求 A 必须在仪器试验后方可使用B 有条件时需做pH 微粒分析C 放置时间不宜过长 尤其是A液 2 可能的问题及解决办法溶血液加入可能出现的问题溶血效果不好温度问题 C液溶血和温度关联较大 一般不能放4 冰箱 可以采用水浴37 溶血剂不够 可以离心后追加溶血剂 以上处理如果还不可以 则需要选择 不重要的标本 重新再标记重要而又没有剩余的标本 反复离心 选择1200 2000转左右的速度 建议每次离心均加入2 3mlNH4Cl溶血素 有些抗体或染料对酸比较敏感 比如PE标记 溶血后会使其脱离 但这种现象是可逆的 静置10 30min 2 可能的问题及解决办法加入Flowcout环节Flowcout必须在加入溶血素后才能加入 否则会影响检测结果 同时加入Flowcout后2hr后必须上机检测 2 可能的问题及解决办法 5 检测出结果环节 A 上机前需要摇匀标本 仪器开机超过30min Flow check10 2 外电压稳定等等 B 方案尽量采用完整方案 比如T亚群 由于Flowcout微球在所有通道上都有信号 一般选择没有使用的荧光通道作为收集通道 如果没有剩余通道 就选择荧光较强的染料所在的通道方案是实现正确操作和得到正确结果的平台 建议建立方案时尽量建立完整方案 2 可能的问题及解决办法C 检测结果1 检测结果必须严格按医学含义得到 比如 CD4 T细胞 CD45 CD3 CD4 CD8 百姓定义上的结果 医学定义上的结果 2 可能的问题及解决办法2 相对计数 一般医院检测T亚群时可以只做相对数 这样就可以使用prism门 CD3 CD4 CD8 如果需要浓度 则从血常规中得到淋巴细胞的浓度 相应的 浓度 即所谓的双平台法 这时我们可以采用缩小设行的办法 得到准确的 3 绝对计数 AIDS往往采用单平台法得到浓度 这样我们可以采用扩大设行方法得到准确的绝对数 2 可能的问题及解决办法3 影响结果的因素 电压 补偿不足或过头均影响阈值设置不合理设门范围Flowcout DNA检测 1 固定问题 70 酒精106细胞700ul冰乙醇 2 3min 300ul蒸馏水 4 72hr 2 离心 1500转3 透膜 tritonx 100 intra1 intra2 细胞因子的检测 1 解决干扰碎片 1 20 静置 24hr 2 4500转 离心 2 强度问题 外延浓度0 5 10 20 CaptureBeads 多种细胞因子FCM STAT 的原理 Color codedMicrospheres FL4 MainMenu Differentiationof10Populations HumanTh1 Th2CytokineIKit FL2 ReporterParameter FL4 DifferentiatorParameter MainMenu HLA B27检测中的问题 利用B27荧光强度判定的阳性率很低 原因 通常B27的判定标准是荧光强度大于8 但这个标准是在加全量抗体的条件下做的 而目前大多数用户只加半量或1 4量做 导致荧光强度降低 解决方法 1加全量抗体 2判定标准改为用阳性率大于90 ANNEXINV PI检测凋亡的问题 结果偏低原因