生化分析翻译作业.doc

2.1.1吸光光度法(280nm)使用注意事项吸光光度法操作起来十分快捷方便，因为并不需要添加额外的试剂或进行预处理。没有蛋白质标准需要准备。吸光光度法不消耗蛋白质，吸光度与蛋白质的浓度呈线性关系。由于不同的蛋白质和核酸俱有各自不同的吸收特性，因此对未知成分的物质或蛋白质的混合物，吸光光度法可能有较大误差。溶液中任何对紫外光有吸收的非蛋白成分都会干扰测定。细胞和组织样品中往往含有会干涉测定的不溶性或有色成分。吸光光度法最常见的用途是监视层析柱分数，或是应用在需要快速估测、蛋白质浓度的误差可以忽略不计的场合。吸光度法在操作时，常用牛血清白蛋白或其他纯蛋白质溶液进行标定。原理溶液中的蛋白质在280和200nm处对紫外光有最大吸收值。含芳环的氨基酸是造成280nm处吸收峰的主要原因，200nm处的吸收峰由肽键引起。二级、三级、四级结构都会影响吸收，所以pH、离子强度等，均可对吸收光谱产生影响。仪器设备除了标准溶液以外，还需要紫外分光光度计和石英比色皿。分析未知的蛋白质或蛋白质的混合物。使用下面的公式来粗略估算蛋白的浓度。大多数分光计的光路长度为1cm。浓度（mg/ml）=280nm处吸光度除以光路长度（cm.）已知吸光系数的纯蛋白质。对于1cm的光路，使用下列公式。浓度的单位是采用mg/ml、%或体积摩尔浓度，取决于操作所使用的系数。浓度=280nm处的吸光度除以吸光系数可按下列关系式转换单位：Mg蛋白/ml=蛋白除以10=质量除以蛋白质分子的摩尔浓度可能遭核酸污染的未知样品。使用下列公式来估算蛋白质浓度：浓度（mg/ml）=（1.55x280nm处吸光度）-（0.76x260nm处吸光度）注意事项冷溶液会使试管起雾，热溶液会释放气泡，从而干扰读数。对于浓缩溶液（吸光度大于2）可简单地对其进行稀释。常用蛋白质标准液的吸光系数：牛血清白蛋白（BSA）：63牛，人，或兔IgG：138鸡卵清蛋白：70参考文献Layne,E.SpectrophotometricandTurbidimetricMethodsforMeasuringProteins.MethodsinEnzymology3:447-455.1957.Stoscheck,CM.QuantitationofProtein.MethodsinEnzymology182:50-69.1990.吸光度测定（205nm）使用注意事项参见波长在280nm处吸光度测定的注意事项。此方法与测定280nm处的吸收一样方便。因为核酸在205nm处的吸收非常小，如果样品被核酸过度污染，这种方法可能是首选的测量方法。设置波长有点棘手，因为205nm正好处于蛋白质吸收峰的肩部。原理见280nm处吸光度测量的讨论。步骤含0.01十二烷基聚乙二醇醚的缓冲液，以防蛋白质在塑料或玻璃表面的吸附。对于在205nm处的检测这是必要，因为稀溶液的损失更高。紫外灯预热（约15分钟）。调整波长为205nm只用缓冲溶液校准吸光度至零测量蛋白质溶液吸光度分析蛋白质浓度（mg/ml）=31（在205nm处的吸收）。注意冷溶液会使试管起雾，热溶液会释放气泡，从而干扰读数。溶液必须比280NM处吸光度检测中使用的更稀。205nm处蛋白质的吸光更为强烈，根据推测也有更少的蛋白质间的变异。除了需要设置一个准确的波长，杂散光也是一大问题。为了避免这些问题，使用10微克/微升牛血清白蛋白作为标准溶液。设定缓冲溶液吸光度为零，通过内插法确定未知样品的浓度（浓度在0至10微克/微升之间）。因为在0至10微克/微升区间内，吸光度和浓度呈线性关系。通过确定210nm处（消光系数的范围从20到24）的吸光度，需要准确设置波长的难题可以避免。但是，这在缓冲体系中反应不敏感，也更多变。参考文献Scopes,RK.Scopes,RK.AnalyticalBiochemistry59:277.1974.Stoscheck,CM.QuantitationofProtein.MethodsinEnzymology182:50-69.1990.未知浓度蛋白质消光系数的测定使用注意事项适用于可用于未知消光系数的纯蛋白质溶液。仪器设备除了标准溶液以外，紫外分光光度计和石英比色皿都是必需的。步骤将溶液稀释30倍在205nm处检测，配置含0.01十二烷基聚乙二醇醚的缓冲液，以防蛋白质在塑料或玻璃表面的吸附。分析使用下面的公式确定205nm处的消光系数：E（205nm）=27+120（280nm处吸光度除以205nm处吸光度）在205nm的读数必须乘以使用公式前的稀释倍数。接下来，确定蛋白质浓度：蛋白质浓度（M）=205nm处吸光度除以定205nm处的消光系数现在可以确定280nm处的消光系数：E(280nm)=蛋白质浓度（M）除以280nm处吸光度注意不正常的苯基丙氨酸含量会极大程度上推翻结果。该技术的准确性取决于氨基酸的平均组成。参考文献Scopes,RK.AnalyticalBiochemistry59:277.1974.Stoscheck,CM.QuantitationofProtein.MethodsinEnzymology182:50-69.1990.Hartree-Lowry和改进Lowry蛋白测定法使用注意事项Lowry分析（1951年）是一种常用的蛋白检测法。有时候，它是为精确测定细胞组分、色谱组分、酶制剂中蛋白质的最好方法。由于建立在同样理论基础上的二喹啉甲酸分析法（BCA）只需一步即可完成，所以需要两部反应的Lowry分析被指出已经过时了（Stoscheck，1990年）。.但是，改进后的Lowry分析完全是在室温下进行的。Hartree版的Lowry分析法，是对Lowry分析法最新的改进。它使用较少的试剂，提高了对一些蛋白质的响应灵敏度，减少了与某些盐溶液不相溶的可能性，提供了更线性的响应。Hartree-Lowry分析法是第一位的方法。原理在碱性条件下，二价铜离子形成含有肽键的化合物而被还原成一价。一价铜离子和酪氨酸、色氨酸和半胱氨酸的活泼基团，与Folin试剂反应生成不稳定的产品，呈现钼/钨蓝色。仪器设备除了标准溶液以外，红外分光光度计和滤光片都是必需的。还可能用到玻璃或（更便宜的）聚苯乙烯试管Hartree-Lowry实验的实验步骤：反应物：试剂A由2克四水合酒石酸钠钾，100克碳酸钠，500毫升1N的氢氧化钠组成，加H20稀释至一公升（即最终浓度为7mM钠钾酒石酸盐，0.81M碳酸钠，0.5N氢氧化钠）。可使用2至3个月。试剂B由2克四水合酒石酸钠钾，1克五水和硫酸铜，90毫升H20，10毫升1N的氢氧化钠组成（即最终浓度为70mM钠钾酒石酸，40mM硫酸铜）。可使用2至3个月。试剂C为1vol Folin-Ciocalteau 加15vol水稀释。检测准备一系列含0.3 mg/ml牛血清白蛋白和未知物的缓冲液，使得浓度从30 to 150 micrograms/ml（0.03至0.15毫克/毫升）。在各个试管里加入1.0ml上述标准缓冲液和0.90ml试剂A，然后混合。在50C水浴加热10min，然后冷却到室温。在各个试管里依次加入0.1ml试剂B，混合均匀后在室温条件下恒温10min迅速在各个试管里依次加入3ml试剂C,混合后在50C的水浴里恒温反应10min，然后冷却到室温。然后定容至5ml。在1cm的试管中测量650nm处的吸光度。分析准备一个吸光度和微克蛋白质的标准曲线（反过来也行）。从曲线上确定数值。从蛋白质试样的体积和稀释倍数来确定原始试样的浓度。修改的Lowry实验步骤（室温）试剂将20g碳酸钠溶解在260ml水中，0.4克5水硫酸铜溶解于20毫升水中，0.2g酒石酸钠钾盐于20ml水中。混合这三种溶液来制备铜试剂。准备100毫升1的十二烷基硫酸钠溶液（SDS）。准备1M氢氧化钠溶液（4/100毫升）。混合3倍的铜试剂和1份SDS和1份氢氧化钠。溶液稳定的2-3个星期。如果 生成白色沉淀，加热溶液至37C。如果有黑色沉淀生成，则丢弃不用。如果三试剂分别储存用前混合，更好。混合10ml2N Folin试剂于90ml水中，制成0.2N的Folin试剂。保存于黄色试剂瓶中，溶液能稳定保存数月。检测用缓冲液稀释试样至约0.025-0.25 mg/ml。如果试样浓度无法估计，建议准备2-3个稀释度范围跨越一个数量级。每份稀释度准备400微升。建议每个稀释度准备三份。准备一个400微升缓冲区的参考。准备不同浓度的标准牛血清白蛋白试液。方法是：稀释0.25 mg/ml牛血清白蛋白试液，加40400微升0.25 mg/ml牛血清白蛋白试液于13 x 100 mm试管中与缓冲液混合在400微升的试管中。加400微升的Lowry，完全混合。在室温下反应10min。快速加入200微升0.2 N Folin试剂，立刻涡旋混合。完全混合必须要迅速完成以避免试剂在于蛋白质反应之前发生分解反应。在室温下反应30min以上。使用玻璃或聚苯乙烯试管测量750nm处的吸光度。如果结果过高，则应该在500nm处测量。评论：修改后的Lowry法吸光度测定只需要10分钟内完成。而以前的原始方法却需要通过颜色的变化来准确测定时间。这个改进对影响因素敏感程度降低，对蛋白质的敏感程度比以前更高。大多数实验中可以用大尺寸的试管进行实验，但是会浪费更多的蛋白质。色氨酸酪氨酸和半胱氨酸残渣中蛋白质含量异常或高或低，会各自造成或多或少的误差。参考文献Lowry, OH, NJ Rosbrough, AL Farr, and RJ Randall. J. Biol. Chem. 193: 265. 1951. Oostra, GM, NS Mathewson, and GN Catravas. Anal. Biochem. 89: 31. 1978. Stoscheck, CM. Quantitation of Protein. Methods in Enzymology 182: 50-69 (1990). Hartree, EF. Anal Biochem 48: 422-427 (1972). 缩二脲测定蛋白质使用注意事项：缩二脲法与Lowry法原理相似，但它涉及到一个单一的反应20分钟。很少有干扰剂（铵盐作为一个这样的代理）。莱恩（1957）报告指出：此方法比用洛瑞或紫外线法偏差小，但是，需要消耗更多的材料。双缩脲是用于蛋白质检测方法的材料中很好的一个，产量是没有问题的。Bradford法更快，更敏锐。原则：在碱性条件下，含有两个或两个以上肽键的物质在反应试剂里与铜盐形成杂紫色。设备除了标准液的处理用品，还需要一种可见光分光光度计。在450nm区有最大的传输。玻璃或聚苯乙烯（便宜）试管也需要。程序试剂：双缩脲试剂的配制：2.25克酒石酸钾钠（282.22），0.75克5水硫酸铜（249.68），1.25克碘化钾（166.0），溶解在100 ml 0.2 M NaOH (40.0)。用蒸馏水稀释至250毫升（当然可以按需要按比例增加或减少用量）。如果有黑色沉淀物则抛弃不用。检测在不同的检测中，试剂样品的量可以按体积比缩放。使用前将分光光度计预热15分钟。准备牛血清白蛋白标准液，最好使用校准系数在280处的吸光度和消光系数。根据已知的用9毫升试剂和1毫升样品的敏感范围是110mg的蛋白质。实际的敏感范围可能超出上限。准备一个盛有1ml缓冲液的标准样品管。如果有可能的话，用缓冲液稀释未知物至1到10毫克/毫升，须有一个稀释范围，如果实际浓度无法估计。每个测定管用1毫升样品。每管加9毫升双缩脲试剂，立刻涡流混合并静置20分钟。在550纳米处读数。分析准备一个吸光度和微克蛋白质的标准曲线（反过来也行）。从曲线上确定数值。从蛋白质试样的体积和稀释倍数来确定原始试样的浓度。评论：颜色是稳定的，但所有的读数应在10分钟内完成。与大多数实验一样，这些缩二脲可缩小体积使用更小试管，消耗较少的蛋白质。蛋白质含量异常高或低的氨基酸与芳香族化合物将有或高或低读数。参考文献Gornall, AG, CS Bardawill, and MM David. J. Biol. Chem. 177: 751. 1949. Layne, E. Spectrophotometric and Turbidimetric Methods for Measuring Proteins. Methods in Enzymology 10: 447-455. 1957. Robinson, HW and CG Hogden. J. Biol. Chem. 135: 707. 1940. Slater, RJ (ed.). Experiments in Molecular Biology. Clifton, New Jersey: Humana Press, 1986. P. 269. Weichselbaum, TE. Am. J. Clin. Pathol. Suppl. 10: 40. 1946Bradford蛋白检测使用注意事项Bradford蛋白检测非常快，和Lowry法检测使用的蛋白质量差不多。此方法非常准确，而且超出范围的试样也可以在几分钟内被检测。Bradford蛋白检测被推荐作为一般的使用，尤其是在凝胶电泳实验中细胞内蛋白质含量和assesing蛋白质浓度的测定。试验材料包括显色剂，蛋白质标准， Bio-Rad公司提供的说明书。下面介绍的方法涉及到100 l的样品和5毫升显色剂。范围约5到200微克蛋白，取决于燃料质量。实验中用5毫升实验室中制备的显色剂，敏感范围为5至接近100微克蛋白。在微测定实验中按比例缩小容器体积（用1 ml的小试管）。原则Coomassie Brilliant Blue G-250的酸液与蛋白质重现相结合时在465 nm 到 595 nm处的最大吸光度。离子相互作用和疏水作用稳定了染料的阴离子形式，引起了明显的颜色变化。该实验方法是很有用的，因为染料蛋白的复合体的消光系数在10倍的浓度范围内是连续的。设备除了标准液的处理用品，还需要一种可见光分光光度计。在595nm区有最大的传输。位于可见光谱的边界（没有特种灯或需要过滤器）。玻璃或聚苯乙烯（便宜）试管可以使用，但会受到显色剂污染，建议使用一次性试管。程序试剂：Bradford试剂：在50 ml 95%的乙醇中溶解100毫克Coomassie Brilliant Blue G-250，加100毫升85（w/v）的磷酸。稀释至1升，当染料完全溶解，过滤器在使用前通过Whatman #1 paper。可以用1 M NaOH如果试样不容易在染色剂里溶解。Bradford试剂是浅棕色的。需要反复过滤来保证试剂中除去蓝色物质。Bio-Rad的浓缩液是昂贵的，但是很多被应用的染色剂已经为了最大的效率而明显的被筛选。“自制”药剂工作的很好，但通常是没有Bio-Rad的