DNA重组实验讲义.doc

DNA重组实验讲义一、实验目的通过本实验学会重组DNA连接以及重组子鉴定的方法。二、实验原理外源DNA与载体分子的连接就是DNA重组，这样重新组合的DNA叫做重组体或重组子。重组的DNA分子是在DNA连接酶的作用下，有Mg2+、ATP存在的连接缓冲系统中，将分别经酶切的载体分子与外源DNA分子进行连接。DNA连接酶有两种：T4噬菌体DNA连接酶和大肠杆菌DNA连接酶。两种DNA连接酶都有将两个带有相同粘性末端的DNA分子连接在一起的功能，而且T4噬菌体DNA连接酶还有一种大肠杆菌连接酶没有的特性，即能使两个平末端的双链DNA分子连接起来。但这种连接的效率比粘性末端的连接效率低，一般可通过提高T4噬菌体DNA连接酶浓度或增加DNA浓度来提高平端的连接效率。T4噬菌体DNA连接酶催化DNA连接反应分3步：首先，T4噬菌体DNA连接酶与辅助因子ATP形成酶-AMP复合物，然后，酶-AMP复合物再结合到具有5磷酸基和3羟基切口的DNA上，使DNA腺苷化；最后产生一个新的磷酸二酯键，把切口封起来。连接反应的温度在37时有利于连接酶的活性。但是在这个温度下，粘性末端的氢键结合是不稳定的。因此人们找到一个折中温度，即1216，连接1216h（过夜），这样既可最大限度的发挥连接酶的活性，又兼顾短暂配对结构的稳定。重组质粒转化宿主细胞后，还需对转化菌落进行筛选鉴定。利用互补现象进行筛选是最常用的一种鉴定方法。现在使用的许多载体都具有一段大肠杆菌半乳糖苷酶的启动子及其编码肽链的DNA序列，此结构称为lacZ基因。lacZ基因编码的肽链是半乳糖苷酶的氨基酸的短片段（146个氨基酸）。宿主和质粒编码的片段各自都不具有酶活性，但它们可以通过片段互补的机制形成具有功能活性的半乳糖苷酶分子。lacZ基因编码的肽链与失去了正常氨基酸的半乳糖苷酶突变体互补，这种现象称为互补。由互补而形成的有功能活性的半乳糖苷酶，可以用X-gal（5-溴-4-氯-3吲哚-D-半乳糖苷）显色鉴定出来，它能将无色的化合物X-gal切割成半乳糖和深蓝色的底物5-溴-4-靛蓝。因此，任何携带着lacZ基因的质粒载体转化了染色体基因组存在着此种半乳糖苷酶突变的大肠杆菌细胞后，便会产生出有功能活性的半乳糖苷酶，在IPTG（异丙基硫代-D-半乳糖苷酶）诱导后，在含有X-gal的培养基平板上形成蓝色菌落。而当外源DNA片段插入到位于lacZ中的多克隆位点后，就会破坏肽链的阅读框，从而不能合成与受体菌内突变的半乳糖苷酶相互补的活性肽，而导致不能形成有功能活性的半乳糖苷酶，因此含有重组质粒载体的克隆往往是白色菌落。三、仪器与试剂1. 仪器恒温摇床、恒温水浴器、恒温培养箱、低温离心机、超净工作台2. 材料与试剂胰蛋白胨、酵母提取物、氯化钠、氨苄青霉素、氯化钙、IPTG、X-gal、KAc、乙醇、琼脂粉、EcoRI酶、T4 DNA连接酶、ATP、大肠杆菌DH5、DNA、pUC19质粒、培养皿、接种针、玻璃涂棒、试管、酒精灯四、实验步骤1. 制备重组DNA 1） 在灭菌的1.5mL离心管中加入制备涂菌的琼脂板pUC19质粒1L（0.5g/L），2L酶切缓冲液，无菌双蒸水16L，1L EcoRI酶，反应混合物总体积为20L，离心混匀，37反应2h。2） 在另一1.5mL离心管中加入DNA 6L（0.5g/L），加入2L酶切缓冲液，无菌双蒸水10L，2L EcoRI酶，反应混合物总体积为20L，离心混匀，37反应2h。3） 分别将酶解液加入1/10（2L）体积的3mol/L醋酸钾(pH5.2)溶液，再加入2倍体积（44L）的无水乙醇，-20冰箱1h（沉淀DNA）。12000r/min 4离心15min，弃上清，加入500L 70%乙醇洗涤沉淀物（悬浮沉淀物），再12000r/min 4离心10min，去上请，开盖放置1015min完全干燥后，加5L TE溶液溶解。4） 将酶切后的2个DNA片段各取4L混合于一0.5mL离心管中，加T4 DNA连接酶缓冲液1L，加1L ATP，1L T4 DNA连接酶，离心混匀，1416保温过夜（22反应2h），并做转化实验。2. 制备涂菌的琼脂板1） 配置LB液体培养基：胰蛋白胨1g，酵母提取物0.5g，氯化钠1g，pH=7.0（1mol/L NaOH溶液100L），蒸馏水100mL。2） 配置LB固体培养基：胰蛋白胨1g，酵母提取物0.5g，氯化钠1g，琼脂粉1.5g,，pH=7.0（1mol/L NaOH溶液100L），蒸馏水100mL。温度为5060时，加入100L氨苄青霉素（100mg/mL），100L IPTG（20 mg/mL），100LX-gal（40 mg/mL），混匀，倒入培养皿，凝固后4保存待用。3. 制备感受态细胞1） 从E.coli DH5平板上挑取一个单菌落于2ml LB液体培养基试管中，37振荡培养过夜。 2） 取0.5ml菌液转接到20ml液体培养基中，37振荡培养2-3h；3） 取1.0ml菌液加入到1.5ml离心管中，冰浴10min；4） 10000rpm离心30s，弃上清液；5） 加入1ml冰冷的0.1MCaCl2溶液悬浮细胞，冰浴30min；6） 10000rpm离心30s，弃上清液；7） 加入100l冰冷的0.1M CaCl2溶液悬浮细胞，即为感受态细胞。4. 转化E.col i1) 在感受态细胞中加入10l连接产物，冰上放置30min；2) 42准确热激90s；3) 立即冰上放置3min；4) 加入400l LB液体培养基，37振荡培养45min；5) 10000 rpm离心30s，弃400l上清，余下层100l上清重新悬浮细胞，将转化的感受态细胞均匀涂在配置好的LB固体培养基皿上。将平皿放置37温箱30min，至液体被吸收。然后倒置平皿，37培养1216h(过夜)，出现菌落，其中白