黑茶中茶多酚和咖啡碱的超临界CO2流体萃取研究

黑茶中茶多酚及咖啡碱的超临界CO2流体萃取研究摘 要：以益阳黑茶为原料，采用超临界CO2萃取技术提取黑茶中的茶多酚和咖啡碱，采用正交试验对萃取温度、萃取压力、夹带剂浓度和夹带剂用量等因素进行优化(固定萃取时间为2 h).采用分光光度法测定茶叶中茶多酚和咖啡碱的含量，根据正交试验极差分析结果得出茶多酚的最佳萃取条件：萃取温度50 ，萃取压力20 MPa，夹带剂采用体积分数为70%的乙醇，适宜用量为100 mL/150 g，得率为(0.1900.004 )%.咖啡碱的最佳萃取条件：萃取温度40 ，萃取压力20 MPa，夹带剂采用体积分数为70%的乙醇，适宜用量为300mL/150 g，咖啡碱得率为(0.457 0.036)%.关键词：茶多酚;咖啡碱;超临界CO2;黑茶中图分类号：TQ914.1 文献标识码：A 文章编号：16727304(2012)03005604Extraction of Tea Polyphenols and Caffeine from Black Tea withSupercritical CO2YIN Zhi-fang, ZHONG Tong-sheng, PENG Xiao-yun, LI Jie, WANG Ke(College of Chemistry and Environmental Engineering, Hunan City University, Yiyang, Hunan 413000, China)Abstract: Supercritical fluid extraction (SFE) was used to extract tea polyphenols and caffeine fromblack tea. Conditions such as teperature, pressure, entrainer agents concentration and the dosage of entrainerwere optimized with orthogonal test (extraction time was 2 hours). The content of tea polyphenols andcaffeine were determined by spectrophotometry. According to the results of orthogonal test, it showed that theoptimum conditions were: the extraction temperature 50 , pressure 20 MPa, 70% ethanol solution (involume ratio) as cosolvent, and the most appropriate amount 100 mL/150 g for tea polyphenols; the extractiontemperature 40 , pressure 20 MPa, 70% ethanol solution (in volume ratio) as cosolvent, and the mostappropriate amount 300 mL/150 g for coffeine. The extraction rate was (0.1900.004)% for tea polyphenolsand (0.4570.036)% for caffeine in this extraction condition.Key words: tea polyphenols; caffeine; supercritical CO2; black tea茶多酚(Tea Polyphenols，TP)，又名茶单宁、茶鞣质，是茶叶中多酚类物质的总称，包括黄烷醇类、花色苷类、黄酮类、黄酮醇类和酚酸类等.绿茶中茶多酚的总量占茶叶干重的15%-35%1，其主要成分为儿茶素，它能高效清除体内自由基1，这种能力使得茶多酚成为了一种天然的抗氧化剂.茶多酚具有防治心脑血管疾病、抗癌、抗突变、降低血压、血糖及抗过敏等多种医学作用.此外，茶多酚还具有消炎杀菌、沉淀金属和增强免疫力等特殊药理功能2.咖啡碱(Caffeine)，又名咖啡因，是茶叶中含量最高的生物碱，含量为2%-5%3，具有使中枢神经系统兴奋、助消化、利尿、醒酒、强心、兴奋心肌、促进机体代谢，增强机体对疾病的抵御力等诸多作用4，在制药以及一些高级饮料和香烟中作为添加剂使用，使用前景广阔.目前常见的茶多酚和咖啡碱的提取以绿茶、红茶等居多，常见的提取方法有：溶剂提取法5-6、微波萃取法7-8、柱层析法9-11、超临界CO2流体萃取法12-15等.上述方法大都单独考察萃取茶多酚和咖啡碱的工艺条件，而采用超临界CO2流体萃取技术同时获取黑茶中茶多酚和咖啡碱的最佳提取条件的研究则较少有报道.本文探讨了超临界CO2萃取技术在提取茶多酚和咖啡碱时的压力、温度、夹带剂浓度及夹带剂用量对茶多酚和咖啡碱提取率的影响，并优化出最佳的提取条件，为工业化生产提供了试验数据依据.黑茶中茶多酚的含量还鲜有报道.1 材料和方法1.1 材料和仪器益阳黑茶、福林酚试剂(1N)、没食子酸标准品(纯度98%)，咖啡碱标准品(纯度98%)，碱式乙酸铅、无水乙醇、甲醇、无水碳酸钠均为分析纯，水为二次蒸馏水.HA121-50-02 型超临界萃取装置(江苏南通华安超临界萃取有限公司);RE2000A 型旋转蒸发仪(上海雅荣生化设备仪器有限公司);U-3010紫外可见分光光度计(日本日立公司);SF-130 型粉碎机(湖南中诚制药机械厂);高速离心机(湘仪离心机仪器有限公司);万分之一分析天平(常州市亨托电子衡器有限公司).1.2 试验方法1.2.1 原料的制备散茶取样：根据GB/T 8302-200216中捆包的散茶取样，从捆包的散茶上、中、下部取样，作为平均样品，装于包装袋中，以待粉碎.茶样磨碎：根据GB/T 8303-200317中的茶叶磨碎方法，先用粉碎机将茶叶粉碎并过60 目筛，然后按GB/T 8304-200318中的120 C烘干法对茶样进行烘干.1.2.2 茶叶中茶多酚和咖啡碱的提取及得率计算采用超临界CO2 为萃取剂，对萃取压力、萃取温度、夹带剂浓度、夹带剂用量进行正交试验设计.每组试验均取茶样150 g，每隔0.5 h 取样1 次，共取样4 次，正交试验设计方案见表1.表1 正交试验因素水平因素水平 萃取温度(A)/ 萃取压力(B)/MPa夹带剂浓度(C)/(%)夹带剂用量(D)/(mLg-1)1 40 15 60 100:1502 40 20 70 200:1503 40 25 80 300:1504 50 15 70 300:1505 50 20 80 100:1506 50 25 60 200:1507 60 15 80 200:1508 60 20 60 300:1509 60 25 70 100:150按如下公式计算.总提取率=总萃取物质量/茶样质量100%.(1)得率=m/M 100%. (2)式中，m 为萃取物中茶多酚或咖啡碱质量;M 为茶样质量.1.2.3 没食子酸标准曲线的测定称取20 mg 没食子酸于20 mL 比色管中用水溶解，定容至刻度，摇匀，得到1 mg/mL 没食子酸储备液(现配).分别吸取0、0.5、1、1.5、2、2.5 mL 没食子酸储备液于50 mL 容量瓶中，用水定容至刻度，摇匀，得到浓度分别为0、10、20、30、40、50 g/mL 的没食子酸工作液.分别移取不同浓度的没食子酸工作液各1 mL 于10 mL 比色管中，标号1-6.然后分别加入5 mL 10%福林酚试剂并摇匀，反应3-8 min 后加入4 mL 7.5%Na2CO3 溶液，加水定容至刻度，摇匀.于室温下放置60 min 后，用10 mm 比色皿、在765 nm 波长下测定吸光度19.1.2.4 咖啡碱标准曲线的测定称取20 mg 咖啡碱于20 mL 比色管中用水溶解，定容至刻度，摇匀，得到1 mg/mL 咖啡碱储备液(现配).准确吸取5 mL 储备液于100 mL 容量瓶中，加水定容至刻度，得到浓度为50 g/mL的咖啡碱母液.分别吸取0、2、4、6、8、10、12 mL 咖啡碱母液于一组50 mL 容量瓶中，各加入2.0 mL 盐酸溶液(0.01 mol/L)，用水稀释至刻度，摇匀，用10 mm 比色皿，在波长272.5 nm处，以试剂空白溶液作参比，测定吸光度(A)20.1.2.5 萃取样中茶多酚及咖啡碱含量的测定用磨口烧瓶从超临界CO2 萃取设备的分离釜中取样，采用旋转蒸发仪旋干萃取样中的溶剂，记录烧瓶取样前后的质量变化.从旋干后萃取物中取适量样品，用水溶解定容至10 mL 离心管中，离心10 min 后，取上清，用水定容至10 mL.取2 mL 移入 20 mL 比色管中，按照没食子酸标准曲线的测定方法测定吸光度15，从而计算萃取物中茶多酚的含量.从旋干后萃取物中取适量样品，加水溶解定容至50 mL.离心10 min 后，取10 mL 上清液，于100 mL 容量瓶中，加入4 mL 0.01 mol/L 盐酸和1 mL 0.5 g/mL 碱式乙酸铅溶液，用水稀释至刻度，混匀，静置澄清过滤.准确吸取滤液25 mL，注入50 mL 容量瓶中，加入0.1 mL 4.5 mol/L 硫酸溶液，加水稀释至刻度，混匀，静置澄清过滤.用10 mm 比色皿，在波长273.5 nm 处，以试剂空白溶液作参比，测定吸光度(A)16，从而计算萃取物中咖啡碱的含量.根据GB/T 8313-200815中茶多酚及GB/T8313-200216中咖啡碱的测定方法，按下式计算萃取物中茶多酚及咖啡碱的含量：目标产物含量(%) 6Std 110010A V dSLOPE m m = . (3)式中，A 为样品测试液吸光度;V 为样品提取液体积(茶多酚：10 mL，咖啡碱：50 mL);d 为稀释因子(茶多酚：10，咖啡碱：20，);SLOPEStd为标准品标准曲线的斜率;m 为样品质量(g);m1为样品干物质含量(%).2 结果和分析2.1 没食子酸及咖啡碱标准曲线采用波长扫描确定没食子酸和咖啡碱标准品的最大吸收波峰位置，在最大吸收波长处进行吸光度的测定，得到的标准曲线如图1 所示.没食子酸标准曲线方程A= 0.012 3c+0.009 9(R2 = 0.999 5).咖啡碱标准曲线方程为A=0.061 6c+0.000 6(R2=0.999 9).图1 没食子酸和咖啡碱标准曲线2.2 茶多酚及咖啡碱含量计算正交试验中所得的萃取样品中仍含有一定量乙醇，采用旋转蒸发仪蒸干，去掉其中的溶剂，得到萃取干物质质量，从干物质中进行取样分析.根据式(1)计算.其中，V= 10 mL，d = 1，SLOPEStd = 0.012 3，m1 = 100%.由此可计算出每组正交试验所得萃取样中的茶多酚和咖啡碱百分含量以及茶多酚和咖啡碱总量，计算结果见表2.表2 萃取样品中的茶多酚及咖啡碱含量序号 萃取样总量/g 茶多酚含量/(%) 茶多酚总量/mg 咖啡碱含量/(%) 咖啡碱总量/mg1 0.167 6 47.04 78.84 30.77 51.572 0.593 0 7.72 45.78 23.00 136.393 0.183 0 12.98 23.75 45.73 83.694 2.315 7 7.67 177.62 24.64 570.605 0.829 9 20.04 166.31 52.15 432.796 0.278 3 7.45 20.73 31.60 87.947 0.315 8 3.51 11.09 28.93 91.368 0.854 5 5.66 48.33 26.21 223.969 1.190 7 5.46 65.03 27.38 326.012.3 茶多酚和咖啡碱得率计算茶多酚和咖啡碱提取物的正交试验结果分析见表3.由正交试验结果极差分析可知，各因素表3 正交试验结果分析编号萃取温度(A) 萃取压力(B) 夹带剂浓度(C) 夹带剂用量(D)总提取率/(%)得率/(%)(茶多酚, 咖啡碱)1 1 1 1 1 0.112 0.053, 0.0342 1 2 2 2 0.395 0.031, 0.0913 1 3 3 3 0.122 0.016, 0.0564 2 1 2 3 1.544 0.118, 0.3805 2 2 3 1 0.553 0.111, 0.2896 2 3 1 2 0.186 0.014, 0.0597 3 1 3 2 0.211 0.007, 0.0618 3 2 1 3 0.570 0.032, 0.1499 3 3 2 1 0.794 0.043, 0.217K1 0.033, 0.603 0.059, 0.158 0.033, 0.081 0.069, 0.180K2 0.081, 0.243 0.058, 0.176 0.064, 0.229 0.017, 0.070K3 0.027, 0.142 0.024, 0.111 0.045, 0.135 0.055, 0.195R 0.054, 0.461 0.035, 0.065 0.031, 0.148 0.052, 0.125对茶多酚得率影响的主次顺序为ADBC.因素B 的K1 和K2 非常接近，因此分别对组合为A2B1C2D1，A2B2C2D1 进行3 次平行试验考察.各因素对咖啡碱得率影响的主次顺序为BACD.最佳萃取条件组合为A1B2C2D3.2.4 最佳萃取条件的验证对茶多酚得率分析可知，因素B 的K1 和K2非常接近， 因此分别对组合为A2B1C2D1 ，A2B2C2D1 进行3 次平行试验考察，结果见表4.在咖啡碱的最优萃取条件A1B2C2D3 下重复3 次试验，结果见表5.表4 茶多酚验证试验总提取率/(%) 茶多酚得率/(%)序号A2B1C2D1 A2B2C2D1 A2B1C2D1 A2B2C2D11 1.517 1.550 0.171 0.1852 1.523 1.565 0.163 0.1933 1.535 1.563 0.174 0.191平均值 1.5250.009 1.5590.008 0.1690.006 0.1900.004表5 咖啡碱验证试验序号 总提取率/(%) 咖啡碱得率/(%)1 1.658 0.4512 1.665 0.4963 1.663 0.425平均值 1.6620.004 0.4570.0363 结论通过4 因素3 水平正交试验设计及优化，得到了超临界CO2 流体萃取黑茶中茶多酚的最佳条件：A2B2C2D1，即萃取温度为50 、萃取压力为20 MPa、夹带剂浓度为70%，夹带剂用量为100 mL/150 g ， 茶多酚的得率为(0.1900.004)%. 咖啡碱的最佳萃取条件为A1B2C2D3，萃取温度40 C，萃取压力20 MPa，夹带剂浓度70%，夹带剂用量300 mL/150 g，在此萃取条件下得到的咖啡碱得率(0.4570.036)%.参考文献：1Nakagawa T, Yokozawa T, Terasawa K, et al. 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