分子标记辅助选择步骤及所需药品配方.doc

附录1：实验程序及所用溶液配方实验程序1：DNA小量提取法（SDS小量提取法）1. 取每个水稻样本新鲜叶片2cm左右于1.5 eppondorf管中，加入液氮磨碎。2. 加入700ul已预热至650C 的SDS抽取液，迅速搅匀后置于650C水中，温浴30min。3. 加入200ul 5MKAc混合液，颠倒充分混匀，冰浴30min后，40C 8000转离心5min，将上层液倒入另一新的1.5ml eppondorf管中。4. 加入等体积的异丙醇，置于-200C 30min，40C 10000转离心4min。5. 弃上清，加入70% 乙醇清洗，晾干。6. 将风干的DNA溶于100ul TE溶液中，存于40C备用。实验程序2：DNA大量提取法（SDS大量提取法）1.准备工作：将DNA提取液放于650C的水浴锅中预热，将异丙醇放于-200C冰箱中预冷，选好50 ml的离心管灭菌。2.每个水稻样本新鲜叶片取1-3g，剪碎，放入研钵，加入液氮磨碎。3.将研磨好的叶片转于50ml的离心管中，加入20ml已预热至650C 的SDS抽取液，迅速搅匀后置于650C水中，温浴20min，以使反应充分完全。4.取出离心管，加入5 ml 5MKAc混合液，颠倒充分混匀，冰浴20min，冰浴期间要将离心管上下颠倒数次。5.加入15ml氯仿，嫩叶片会起泡沫，老叶片则变成墨绿或变黑。室温下以3000（10000 rmp的速度离心 3min），将上层液倒入另一新的50 ml离心管中。6.加入等体积的异丙醇，轻轻摇晃直至形成DNA絮状沉淀。7.待DNA结块，用玻棒挑出DNA，用75%乙醇清洗两次，将乙醇到掉，晾干。 8. 将风干的DNA溶于500ul TE溶液中，存于40C备用。SDS抽提液 1M Tris-Hcl 100ml Ph 8.0 0.5MEDTA 100ml pH 8.0 5MNaCl 100ml 10%SDS （十二烷基硫酸钠） 125ml 加蒸馏水定容至1000ml。5MNaCl 100ml 在80ml水中溶解29.22gNaCl加水定容至100ml，分装后高压灭菌10%SDS （十二烷基硫酸钠） 1000ml在900ml水中溶解100g电泳级SDS，加热至68助溶，加入几滴浓盐酸调节溶液的PH值至7.2，加水定容至1000ml，分装备用。5M KAC混合液（100ml） 60ml 5M 醋酸钾 11.5ml 冰醋酸 28.5ml H2O5M 醋酸钾 1000ml将491g醋酸钾（1M为98.2g）溶解于90ml纯水（Mill-Q水或相当级别的水）中，用2mol/L乙酸调节PH值至7.5后加入纯水定容到1L，保存于-20。TE (pH 8.0) 100ml 10 mM Tris-HCl ( pH 8.0) 1ml (1M, ph 8.0) 1mM EDTA (pH 8.0) 0.2ml (0.5M, ph 8.0)加蒸馏水定容至100ml,高温灭菌。0.5M EDTA (pH 8.0) 18.61g Na2EDTA-2H2O 溶于80mlH2O中，用NaOH 调pH至8.0，定容至100ml， 高温灭菌，室温保存。1M Tri-HCl (pH 8.0) 在800ml 水中溶解121.1g Tris碱，加入浓HCl调节pH值至所需值。（参分子克隆，金冬雁等，1996） 实验程序4：PCR扩增 （一）PCR 反应体系 20ul 体系 终浓度Primer pair (4uM) 2ul 0.4 uM10buffer 2ul 1buffer Mg2+(25mM) 2ul 2.5uM dNTPs(10mM) 0.3ul 133ul Taq酶（4u/ul） 0.25ul 1U/20ul DNA(20ng/ul) 2ul 1.5ng/ul Sterile water 11.45ul (二) PCR 反应程序SSR 94,5min 94,1min 53,1min 72,10min 4,保存 72，1.5min (35个循环)实验程序5： 聚丙烯酰胺凝胶电泳（一） 制胶30% acrylamide (丙烯酰胺)胶贮存液 acrylamide 290g bis-acrylamide(双叉丙烯酰胺) 10g先溶于总体积为600ml的水中，加热至37溶解，定容至1000ml。 4保存于棕色瓶中。10%过硫酸铵（ammonium persulphate） 超纯过硫酸铵 2g 超纯水 18ml10TBE buffer Tris base 54g Boric acid(硼酸) 27.5g 0.5M EDTA(ph 8.0) 18.625ml搅拌溶化，定容至500ml.40的蔗糖上样缓冲液（100ml） 蔗糖40g+60ml水+0.025g二甲苯蓝+0.025g溴酚蓝非变性聚丙烯酰胺凝胶电泳分离A凝胶的灌制（1）玻璃板的清洗：用洗涤灵或洗衣粉把玻璃板反复擦洗干净，用蒸馏水冲洗干净，放置干燥备用。（酒精擦洗）操作中，防止两玻璃板相互污染，彻底干燥后再进行玻璃板组装、灌胶。（2）玻璃板的组装：将玻璃板组装好，有缝隙的一边用2.0%的琼脂糖（2 g琼脂糖+98ml水）封住，将封好的玻璃板组装在电泳槽上待用。（3）电泳凝胶的配置（用6的非变性凝胶）组分 用量30丙稀酰胺 8ml1TBE 32ml10%过硫酸铵 270lTEMED 25l终体积 40ml按以上顺序加入各组分（TEMED一定要最后加入），充分摇匀后将配好的胶轻轻灌入两玻璃板之间，当胶加到上部时，在灌胶口插入梳子，并防止梳子底部产生气泡。（要根据胶框选取合适的梳子，以防产生胶膜，影响点样）若有漏出应及时补加聚丙烯酰胺溶液。置于室温让其聚合30min以上。B扩增产物的电泳(1)电泳缓冲液：待凝胶聚合后，在电泳槽中加入1TBE的电泳缓冲液。(2)预电泳：将梳子轻轻拔出，200V预电泳1030min。(3)上样：预电泳后，将PCR产物4l和40的蔗糖上样缓冲液0.5l混合，用移液枪吸取混合液轻轻加入点样孔，尽量缩短加样时间。(4)电泳条件：接上电源，电泳。参数为恒压200V，电泳1.5h(视DNA分子量大小及带型差异的可辨程度，调整电泳时间)。电泳结束后，切断电源，倒去电泳缓冲液，卸去玻璃板，去掉琼脂糖封胶，准备染色。C扩增产物的快速银染法(1)固定：10的乙醇500l冰乙酸，摇匀后加入凝胶，摇35min。(2)染色：1ml 20%AgNO3后平行摇58min。(3)漂洗：倒掉定影液，加入蒸馏水漂洗2