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文档简介

质粒DNA转化感受态大肠杆菌一、实验原理转化（transformation）是将一种生物（供体）的遗传物质（通常为DNA）转入另一种生物（受体）并使其在受体中得以保存和繁殖的过程。大肠杆菌不是天然感受菌，在低温（05）环境下经CaCl2处理，细胞壁变松变软后能摄入外源DNA，这种状态称为感受态细胞（competent cell）。质粒DNA或重组DNA粘附在细菌细胞表面，经过42C短时间的热击处理，促进吸收DNA.然后在非选择培养基中培养一代，待质粒上所带的抗菌素基因表达，就可以在含抗菌素的培养基中生长。二、实验材料准备1. 器材 微量移液取样器，移液器吸头，恒温水浴锅，制冰机，恒温摇床，培养皿（已铺好固体LB-Amp），超净工作台，酒精灯，玻璃涂棒，1.5 ml Eppendorf管，50 ml离心管，乳胶手套，恒温培养箱 2. 试剂 LB液体培养基、LB固体培养基、100mg/ml 氨苄青霉素(或卡拉霉素) 、感受态细胞3. 材料处理转化之前超净台紫外照射15-20min；枪头、50ml离心管需提前灭菌，烘箱烘干；液体LB培养基灭菌后放到冷库，防止长菌；三、 转化 1从-70冰箱中取200l感受态细胞悬液,置冰上解冻1-2 min。2 加入质粒DNA溶液(含量不超过50ng,体积不超过10l),轻轻摇匀,冰上放置30分钟。 342水浴中热击90秒, 然后迅速置冰上2min，整个过程不要振荡菌液。 4向管中加入200l LB液体培养基(不含抗生素),混匀后37振荡培养（225 rpm）1小时,使细菌恢复正常生长状态,并表达质粒编码的抗生素抗性基因。 5. 将上述菌液摇匀后涂布于含Amp（或kna）的LB琼脂平板上,正面向上放置半小时,待菌液完全被培养基吸收后,37倒置培养12-16小时。四、注意事项1. 加液体LB培养基之前观察其是否长菌2. 玻璃涂布棒上的酒精熄灭后稍等片刻，待其冷却后再涂3. 提前打开水浴锅，将温度调到42度4. 实验目的是表达蛋白，可热击完直接涂平板；目的是质粒扩增或后续要PCR，需在热击后37振荡培养复苏1小时5. 实验室常用
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