H9流感抗原性及免疫原性分析20120222.doc

第一章 引言1 流感概述流感病毒（influenza virus）属于正粘病毒科（Orthomyxoviridae），流感病毒属，具有囊膜的分节段负链RNA病毒。病毒内部由单链核糖核酸和核蛋白组成，根据核蛋白(NP)和基质蛋白（M）的抗原性不同，分为A、B和C三种类型，它们之间的抗原差异可以通过可以通过琼脂扩散试验验证。三种类型的病毒由于在结构方面存在较大差异，致病性方面也有不同。1.1 第二章 27株流感病毒的免疫原性分析1 材料与方法1.1病毒分离株27株H9N2流感病毒分离株均由上海兽医研究所流感实验室鉴定并保存。病毒具体信息见表1表1 27株H9N2流感病毒分离表采样地点病毒名称采样地点病毒名称上海Ck-Shanghai-1-06广东Ck-Guangdong-1214-09Ck-Shanghai-2-04Ck-Guangdong-1258-09Ck-Shanghai-4-06Ck-Guangdong-1351-09Ck-Shanghai-5-03Ck-Guangdong-1494-09Ck-Shanghai-6-03Ck-Guangdong-1683-09Ck-Shanghai-50-09江苏Ck-Jiangsu-825-09Ck-Shanghai-96-09Ck-Jiangsu-925-09Ck-Shanghai-169-09湖南Ck-Hunan-2106-09Ck-Shanghai-340-09Ck-Hunan-2230-09Ck-Shanghai-441-09Ck-Hunan-2351-09Ck-Shanghai-510-09山东Ck-Shandong-2552-09安徽Ck-Anhu-1-10Ck-Shandong-2567-09吉林Ck-Jilin-3-09福建Dk-Fujian-1753-09F株Vaccine1.2 SPF鸡胚和SPF鸡SPF鸡胚购自北京梅里亚公司，SPF鸡饲养于负压隔离其中。1.3 H9N2流感病毒的鉴定血清学鉴定：流感病毒分离阳性血清H3、H4、H5、H9和H10标准阳性血清由本实验室制备并保存。PCR鉴定：在所收集的尿囊液有血凝，而不能和标准阳性血清进行中和反应的毒株，分别提取尿囊液RNA，反转录形成cDNA后用流感病毒的PCR方法进行鉴定。1.4 H9N2流感病毒的有限稀释法纯化及EID50测定实验用27株H9流感病毒分别应用有限稀释法进行纯化，方法：吸取病毒尿囊液50l加入到含青霉素1000U/ml，链霉素1000U/ml的450l PBS中，依次进行10倍比稀释，然后以不同稀释倍数的病毒液接种911日龄SPF鸡胚，每枚100l，平行3胚。接毒后鸡胚继续孵化箱中孵育48h后测定血凝，收取并保存最高稀释倍数具有最高血凝价的鸡胚尿囊液，用于下一轮纯化。如此连续经过3次纯化后，把最后收取的尿囊液105稀释，再次以100l接毒SPF鸡胚，48h收取尿囊液，混匀后分装-80保存，分装的H9病毒液经鉴定无污染后用于后续实验。为防止传代过程中H9流感病毒传代丢失及出现杂病毒的情况，实验中对每一次收取的尿囊液进行了血凝学及PCR鉴定，准确无误后用于下一轮纯化。EID50测定：吸取分装病毒尿囊液50l加入到含青霉素1000U/ml，链霉素1000U/ml的450l PBS中，依次进行10倍比稀释，然后以不同稀释倍数的病毒液接种911日龄SPF鸡胚，每枚100l，平行3胚。接毒后鸡胚继续孵化箱中孵育48h后测定血凝，根据Reed-Muench方法计算EID50结果。1.5 H9N2流感病毒血清的制备选择经纯化的25株H9N2流感病尿囊液，以终浓度0.3%甲醛灭活24h，然后以3：7的关系和疫苗用油乳剂剧烈震荡混合制作灭活疫苗。经滴水检验合格后，以0.5 ml/只 颈部皮下免疫4周龄SPF鸡。第21天颈部处死所有SPF免疫鸡，收集血清，分装后于-20保存。1.7 H9N2流感病毒血凝抑制实验用25株H9N2流感病毒和25种制备的对应阳性血清分别交叉进行血凝抑制反应。实验用体积浓度为0.5%的红细胞，配制的病毒抗原为816单位。此实验重复两次。1.8 代表抗原性差别“r”值的计算“r”值计算方法参照动物病毒学第二版第723页，“r”值代表两毒株之间的抗原差异，等于1表示两毒株抗原性相同，随着值的增加两毒株的差异愈大，亦抗原的相关性愈小，当值大于4时，表示两毒株抗原差异性显著。1.9 H9N2流感病毒中和实验测定27株H9N2流感病毒HA基因序列，对1683bp长度的开放阅读进行遗传进化树分析后，选取各分支中的11株病毒进行鸡胚中和实验。病毒配制：在无菌条件下，用4保存的含有青霉素1000U/ml，链霉素1000U/ml的PBS分别稀释11株流感病毒，使病毒含量为100EID50/100l，冰上保存。血清配制：吸取11株流感病毒的阳性血清7.5l加入到装有1495l PBS的2ml EP管中，混匀后，吸取以上液体400l与400l PBS混合，以实现2倍比稀释，按照以上步骤依次进行2倍比稀释，使血清实现200、400、800、1600和3200倍稀释。中和过程：吸取配置好的100EID50/100l的病毒液400l依次加入不同稀释倍数的400l血清中，上下颠倒混匀后，将混合液于37静置1h，期间混合液上下颠倒混匀2次，以实现病毒和血清更好结合，之后取出置于冰上。接胚：将37恒温箱中取出的液体接种911日龄鸡胚，每胚200l，平行3胚，鸡胚37孵化箱中继续孵育48h后，检测并记录血凝结果，根据Reed-Muench方法计算血清对100EID50病毒的半数中和效价。1.10 代表血清抑制性差别“R”值的计算“R”值计算方法参照动物病毒学第二版第723页方法略作修改。“R”值代表两血清之间的差异，等于1表示两血清对抗原具有相同的抑制效果，随着值的增加血清抑制效价差异愈大，当值大于4时，表示两血清差异性显著。2 结果2.1 27株H9N2流感病毒EID50测定结果在结果中采用了EID50/100l的记录方式，其中数值分布于7.759.50之间，其中Ck-Jiangsu-925-09最高，Ck-Anhu-1-10最低。具体见表2表2 27株H9N2流感病毒EID50测定结果病毒编号EID50/100l病毒编号EID50/100lCk-Jiangsu-825-098.75Ck-Shanghai-5-038.50Ck-Jiangsu-925-099.50Ck-Shanghai-6-039.25Ck-Guangdong-1214-099.25Ck-Shanghai-50-098.50Ck-Guangdong-1258-098.75Ck-Shanghai-96-098.50Ck-Guangdong-1351-098.75Ck-Shanghai-169-098.50Ck-Guangdong-1494-099.25Ck-Shanghai-340-099.50Ck-Guangdong-1683-098.50Ck-Shanghai-441-099.50Dk-Fujian-1753-098.75Ck-Shanghai-510-099.25Ck-Hunan-2106-099.25Ck-Hunan-2351-098.50Ck-Hunan-2230-098.25Ck-Shandong-2552-099.25Ck-Shanghai-1-068.75Ck-Shandong-2567-098.75Ck-Shanghai-2-048.25Vaccine8.75Ck-Jilin-3-098.25Ck-Anhu-1-107.75Ck-Shanghai-4-068.252.2 H9N2抗原性结果通过交叉血凝抑制结果可以看出，我国20092010年间流行的H9N2流感病毒和2006年及以前的抗原性，发生了明显的差异，其中Ck-Shanghai-2-04、Ck-Shanghai-4-06、Ck-Shanghai-5-03、Ck-Shanghai-6-03及Vaccine和新近分离的H9N2流感病毒制备的阳性血清血凝抑制值明显较20092010年分离株之间产生的低，而新近分离的病毒阳性血清间，具有良好的血凝抑制反应（假定血清中，每种灭活病毒刺激机体产生的抗体含量相同）。具体见表3通过“r”值的计算结果可以看出，25株流感病毒大致可以分为2个抗原群，其中Ck-Shanghai-6-03和剩余24株病毒的“r”值差别很大，大部分表现为“r”4，独自归为一个抗原群。其余24株病毒“r”值差别不明显，大部分表现“r”4，可归为一个抗原群。具体见表4在划分的第二个抗原群中，20092010分离的病毒除Ck-Guangdong-1214-09外，和实验中早年分离毒株存在一定的抗原差异。有趣的是Ck-Shanghai-4-06是个例外，此病毒和所有的实验病毒抗原差异均不明显。在实验病毒中，Ck-Shanghai-441-09既能对20092010年病毒分离株产生理想的血凝中和效果，也能有效中和早年分离的病毒，可做为现实疫苗生产的候选疫苗毒株。2.3 H9N2中和实验结果通过HA基因遗传进化树的分析结果（后续实验），在鸡胚上进行了中和实验，结果见表5，通过“R”值的计算可以看出血清对病毒中和的效果大致可分为3类，第一类，包括3株病毒，分别为Ck-Shanghai-441-09、Ck-Hunan-2230-09和Dk-Fujian-1753-09，第二类，包括6株病毒，分别为Ck-Jilin-3-09、Ck-Guangdong-1258-09、Ck-Guangdong-1494-09、Ck-Shanghai-1-06、Ck-Guangdong-1214-09和Ck-Shanghai-2-04。第三类，包括2株病毒，分别为Vaccine Ck-Shanghai-6-03。在“R”值大小的关系角度看，第一类血清之间差异极小，第二类血清间较第一类之间差异大，第三类血清之间差异较第二类之间更大。第一类和第二类之间血清差异存在不确定性，有大有小，同样第二类和第三类之间也存在不确定性，但第一类和第三类血清之间血清的中和效果存在明显的差异。具体结果见表6由于第一类血清相对于其它组血清对病毒具有更好的中和效果，可以候选作为疫苗生产的候选毒株组。表3：25株H9N2流感病毒的交叉血凝抑制结果 病毒血清 Ck-Jiangsu-825-09Ck-Jiangsu-925-09Ck-Guongdong-1214-09Ck-Guangdong-1258-09Ck-Guangdong-1351-09Ck-Guangdong-1494-09Ck-Guangdong-1683-09Dk-Fujiang-1753-09Ck-Hunan-2106-09Ck-Hunan-2230-09Ck-Shanghai-1-06Ck-Shangha-2-04Ck-Jilin-3-09Ck-Shanghai-4-06Ck-Shanghai-5-03Ck-Shanghai-6-03Ck-Shanghai-96-09Ck-Shanghai-169-09Ck-Shanghai-340-09Ck-Shanghai-441-09Ck-Shanghai-510-09Ck-Hunan-2351-09Ck-Shandong-2552-09Ck-Shandong-2567-09VaccineCk-Jiangsu-825-0913131114141414111312101010879131513131212121210Ck-Jiangsu-925-09141515151615121214141111129810151613151516121311Ck-Guongdong-1214-09111415131514131315141081077713131214131212128Ck-Guangdong-1258-0914151615151515131514108965914161314131414148Ck-Guangdong-1351-0913141315151413131413107955814131212121112117Ck-Guangdong-1494-091415151515151413151412813108912121013151212128Ck-Guangdong-1683-091413141415141413131310119978141413131312111011Dk-Fujiang-1753-091415151514151414151591098811131614141513131310Ck-Hunan-2106-091214141515151413151597967712161312111112117Ck-Hunan-2230-0911121213131412131315991066714121212111212119Ck-Shanghai-1-0615151516161513141616141013989151513141414141410Ck-Shangha-2-0412131413131411131313121110989131312121210111111Ck-Jilin-3-0914141515151514141516101010879141312131313141410Ck-Shanghai-4-0615151616161615141516121212101112151413131414141412Ck-Shanghai-5-031413151414141312131411111110910141411121312121311Ck-Shanghai-6-0313141214141413131414911119813141312121312121211Ck-Shanghai-96-09141416161616141616161010119810151514131414141310Ck-Shanghai-169-09141516161616151615161211128811151513141415141411Ck-Shanghai-340-0913131414141413131314910107811131312121212131210Ck-Shanghai-441-09141616161615161415161111118811151413141313141411Ck-Shanghai-510-09141515151615141514151010107610131614131514131310Ck-Hunan-2351-0914151515161616141516101110889141613131414141411Ck-Shandong-2552-0913141515151414131414910128810141512131412121110Ck-Shandong-2567-0913151515151514131515109107681416121313138129Vaccine1213131414161313151391111886131212121312121211表4：25株H9N2流感病毒的抗原“r”值结果 病毒血清 Ck-Jiangsu-825-09Ck-Jiangsu-925-09Ck-Guongdong-1214-09Ck-Guangdong-1258-09Ck-Guangdong-1351-09Ck-Guangdong-1494-09Ck-Guangdong-1683-09Dk-Fujiang-1753-09Ck-Hunan-2106-09Ck-Hunan-2230-09Ck-Shanghai-1-06Ck-Shangha-2-04Ck-Jilin-3-09Ck-Shanghai-4-06Ck-Shanghai-5-03Ck-Shanghai-6-03Ck-Shanghai-96-09Ck-Shanghai-169-09Ck-Shanghai-340-09Ck-Shanghai-441-09Ck-Shanghai-510-09Ck-Hunan-2351-09Ck-Shangong-2552-09Ck-Shandong-2567-09VaccineCk-Jiangsu-825-091.0-Ck-Jiangsu-925-091.41.0-Ck-Guongdong-1214-098.01.41.0-Ck-Guangdong-1258-091.01.01.41.0-Ck-Guangdong-1351-091.41.02.01.01.0-Ck-Guangdong-1494-091.01.01.41.01.41.0-Ck-Guangdong-1683-090.74.02.01.01.41.41.0-Dk-Fujiang-1753-092.02.01.41.41.41.42.01.0-Ck-Hunan-2106-092.82.01.41.01.41.02.01.41.0-Ck-Hunan-2230-095.64.04.02.84.02.04.01.42.01.0-Ck-Shanghai-1-062.02.84.02.82.82.05.65.64.04.01.0-Ck-Shangha-2-042.02.04.05.68.04.02.82.08.04.02.81.0-Ck-Jilin-3-090.71.41.01.41.40.351.41.41.40.71.41.41.0-Ck-Shanghai-4-061.02.02.02.84.00.71.02.04.02.82.81.01.01.0-Ck-Shanghai-5-031.44.02.05.65.62.02.82.84.04.04.01.41.40.51.0-Ck-Shanghai-6-034.04.022.45.68.05.68.02.811.211.222.44.02.82.04.01.0-Ck-Shanghai-96-091.41.41.41.01.02.01.41.02.01.04.02.81.01.42.04.01.0-Ck-Shanghai-169-090.70.71.40.51.42.01.00.350.72.02.02.01.02.82.04.01.01.0-Ck-Shanghai-340-090.71.41.41.01.42.81.00.71.41.44.01.41.02.02.02.01.01.41.0-Ck-Shanghai-441-091.00.50.70.71.41.40.71.02.01.42.82.01.02.82.84.01.41.41.41.0-Ck-Shanghai-510-092.01.02.02.02.01.02.00.74.04.05.64.02.04.05.65.62.81.01.42.81.0-Ck-Hunan-2351-091.40.52.01.02.01.41.01.42.81.44.04.01.42.02.88.01.40.51.42.01.41.0-Ck-Shandong-2552-091.00.71.00.51.01.41.41.01.41.42.82.00.251.01.42.80.70.50.70.71.01.01.0-Ck-Shandong-2567-091.00.71.00.51.41.02.01.01.41.42.02.80.51.42.05.61.00.351.00.71.40.75.61.0-Vaccine2.02.05.64.05.62.01.42.04.04.08.01.01.01.41.411.22.82.81.42.02.82.01.42.01.0表5：11株H9N2流感病毒中和实验结果 病毒 血清Ck-Shanghai-441-09Ck-Hunan-2230-09Dk-Fujian-1753-09Ck-Jilin-3-09Ck-Guangdong-1258-09Ck-Guangdong-1494-09Ck-Shanghai-1-06Ck-Guangdong-1214-09Ck-Shanghai-2-04VaccineCk-Shanghai-6-03Ck-Shanghai-441-097610905090503806538053809050905013466371132Ck-Hunan-2230-091346113226909529529522001132366200200Dk-Fujian-1753-09380653805380380645247610380676101132476672Ck-Jilin-3-0953801902226322632263113211322262566566476Ck-Guangdong-1258-093806538026906723806190219024524200200672Ck-Guangdong-1494-0922632690380611327610761022622690672200952Ck-Shanghai-1-06380645247610190276104524905038061132336200Ck-Guangdong-1214-096729524524336190219024762262200200200Ck-Shanghai-2-041346952134656647695211321132672952672Vaccine22621132113220045249522005666721132336Ck-Shanghai-6-034764764762001132200566566190213463806表6：11株H9N2流感病毒中和实验抗原“r”值的计算结果 病毒血清Ck-Shanghai-441-09Ck-Hunan-2230-09Dk-Fujian-1753-09Ck-Jilin-3-09Ck-Guangdong-1258-09Ck-Guangdong-1494-09Ck-Shanghai-1-06Ck-Guangdong-1214-09Ck-Shanghai-2-04VaccineCk-Shanghai-6-03Ck-Shanghai-441-091.00-Ck-Hunan-2230-090.841.00-Dk-Fujian-1753-091.090.651.00-Ck-Jilin-3-090.921.191.191.00-Ck-Guangdong-1258-091.190.921.272.381.00-Ck-Guangdong-1494-092.181.831.193.671.411.00-Ck-Shanghai-1-061.413.361.273.081.542.591.00-Ck-Guangdong-1214-091.681.540.592.591.01.833.361.00-Ck-Shanghai-2-041.681.541.542.185.192.832.182.591.00-Vaccine2.382.383.364.752.184.7612.344.750.841.00-Ck-Shanghai-6-037.336.178.09.514.3612.3419.039.511.413.361.003 讨论第三章 H9N2流感病毒对BALB/c小鼠的致病性研究1 材料与方法1.1 实验用毒株分离选定的27株H9N2病毒流感病毒。1.2 实验动物180只45周龄BALB/c雌性小鼠购自上海莱斯克实验动物有限公司，饲养于正压隔离器中。1.3 实验过程在生物安全柜内，以4保存的无菌PBS稀释病毒尿囊液至106EID50/50l后，将稀释液置于冰上，依次稀释27株病毒。小鼠接毒时，将小鼠放入含有干冰的烧杯内，干冰上层覆盖白纸数层，防止小鼠和干冰直接接触。小鼠放入烧杯内后，开始小鼠在烧杯内活跃，数秒后栽倒于烧杯内，栽倒3秒左右，左手拇指和食指捏住颈部皮肤迅速取出小鼠，同时右手持枪内先前已经稀释好的50l病毒稀释液缓慢滴于小鼠鼻孔周围，液体随小鼠呼吸吸入鼻孔内，病毒液边吸入边滴下，从小鼠在烧杯内取出到病毒全部被小鼠吸入，整个过程控制在10秒以内为好。左手捏持小鼠颈部皮肤从烧杯取出过程中，避免捏持过紧，因为这样会造成小鼠呼吸不畅，引起接毒失败甚至小鼠窒息死亡。接毒完毕后，迅速将小鼠置于正压隔离其中。每株H9N2病毒，接毒小鼠6只，接毒当日称取3只小鼠体重，连续进行14天；在接毒后第4天处死每株接毒小鼠3只，采集脾脏、肾脏、肺脏、脑和鼻腔至2ml EP管中，-80保存用于病毒含量滴定。1.4 BALB/c鼠脏器采集将小鼠置于含干冰的烧杯内，麻醉后迅速用剪刀剪断腋下动脉，将小鼠轻贴于吸水纸上，防止血液滴洒于操作台，待血液放净后，用75%酒精棉球擦拭小鼠腹部至胸部之间。左手持镊夹持腹部皮肤并提起，右手用剪刀剪破皮肤扩大开口至鼠颈部颌下，充分分离左右两侧皮肤和肌肉的连接，为操作方便可以剪开腹部两侧皮肤，以扩大操作空间。此后，剪开腹腔，使腹腔脏器充分暴露，分别采集脾脏和两侧肾脏至2ml EP管中并置于冰上。剪开胸腔，把整个肺脏取出至2ml EP管中。翻转死亡小鼠，用75%酒精消毒浸湿脑部皮肤，左手持镊固定，右手用剪刀从枕骨处剪开脑部皮肤，充分扩大创口后，用剪刀于枕骨部剪开脑盖骨，两边弧线剪开并掀起脑盖，取出完整的脑至2ml EP管中。小鼠鼻腔较短，充分剪除鼻两测皮肤及鼻吻，用剪刀于眼孔下缘剪断鼻骨并至2ml EP管中。标记装有脏器的EP管后置于冰上，整理操作台面后，进行下一只小鼠的实验，从小鼠处死开始至整个实验结束控制在8min以内。所有实验操作均在无菌的状态下操作，所用器具均进行高压灭菌处理，金属器械在采集一个脏器后均用75%酒精浸泡，之后用纸巾擦拭干后用于下一脏器的采集。1.5 滴定脏器病毒含量取出-80冰箱中含有脏器的2ml EP管，其中加入直径为4mm的钢珠2颗，加入含有青霉素1000单位和链霉素1000单位的PBS 1ml，于组织研磨机内震荡研磨，震荡频率为60HZ，震荡时间为2min。脏器研磨后于4，10000RPM/min的条件下离心10min，吸取上清液马上用4保存的无菌PBS进行10倍比稀释，将不同稀释倍数的稀释液接种911日龄鸡胚，孵化箱继续孵育48h，之后检测并记录血凝结果，根据Reed-Muench方法计算病毒含量。2 结果2.1 27株H9N2流感病毒BALB/c脏器的分离结果对27株H9N2感染小鼠第4天采集的5个脏器进行了病毒含量滴定，结果为在所有小鼠的脾脏、肾脏和脑均没有分离到病毒，此结果表明病毒在这些脏器没有复制或者复制量很低，不足以用鸡胚滴定方法进行有效的测定。但是，在小鼠的肺脏和鼻腔部分毒株分离到了病毒。其中，肺脏只有7株病毒在所有的3只小鼠能够分离到病毒，病毒含量在1.755.25lg（EID50/100l）之间，最低的为Ck-Guangdong-1258-09，最高的为Vaccine。在17株病毒感染的小鼠肺脏内没有分离到病毒。在3株病毒感染的小肺脏，小鼠部分肺脏分离到了病毒，其中Ck-Jiangsu-925-09和Ck-Guangdong-1258-09只在1只小鼠内分离到了病毒，且病毒含量为0.75，表现为病毒含量很低，但在病毒Ck-Shanghai-169-09有2只小鼠分离到病毒，病毒含量为3.75和4.50，另1只小鼠没有分离到病毒可能由于操作或者个体差异所致。总体上，27株H9N2病毒感染的小鼠中，有10株病毒感染小鼠在肺脏分离到病毒，17株没有分离到。具体见表1鼻腔病毒的分离状况则比较复杂，其中12株病毒在所有的3只小鼠鼻腔能够分离到病毒，病毒含量在1.085.75lg（EID50/100l）之间，其中最低的为Ck-Anhu-1-10，最高的为Vaccine。在2株病毒感染的小鼠鼻腔没有分离到病毒。在13株病毒感染的小鼠部分分离到病毒。总体上，27株H9N2病毒感染的小鼠中，有25株病毒感染小鼠在鼻腔分离到病毒，2株没有分离到。具体见表1在肺脏和鼻腔同时分离到的病毒共有6株，分别为Ck-Guangdong-1258-09、Ck-Shanghai-1-06、Ck-Shanghai-5-03、Ck-Shanghai-6-03、Ck-Shanghai-50-09和Vaccine，如果肺脏3只分离到，而鼻腔2只分离到的情况，则可以再加病毒Ck-Shanghai-2-04，共有7株病毒。具体见表1表1 N9N2流感病毒感染后第4天鼻腔和肺脏的分离结果病毒名肺脏病毒含量EID50/100l鼻腔病毒含量EID50/100lCk-Jiangsu-825-09Negative1.50,-,-Ck-Jiangsu-925-09-,0.75,-0.75,-,-Ck-Guangdong-1214-09Negative0.75,-,0.75Ck-Guangdong-1258-091.750.003.080.29Ck-Guangdong-1351-09-,0.75,-3.500.90Ck-Guangdong-1494-09Negative2.501.25Ck-Guangdong-1683-09Negative1.750.50Dk-Fujian-1753-09Negative-,-,1.25Ck-Hunan-2106-09Negative2.001.23Ck-Hunan-2230-09NegativeNegativeCk-Anhu-1-10Negative1.080.29Ck-Shanghai-1-064.081.234.330.52Ck-Shanghai-2-041.830.631.25,-,1.75Ck-Jilin-3-09Negative0.75,-,-Ck-Shanghai-4-06Negative-,0.75,-Ck-Shanghai-5-035.250.434.081.61Ck-Shanghai-6-032.081.264.000.43Ck-Shanghai-50-093.000.663.670.52Ck-Shanghai-96-09Negative2.25,-,-Ck-Shanghai-169-093.75,4.50,-2.75,-,1.50Ck-Shanghai-340-09Negative-,-,0.75Ck-Shanghai-441-09NegativeNegativeCk-Shanghai-510-09Negative-,0.75,-Ck-Hunan-2351-09Negative2.501.25Ck-Shandong-2552-09Negative-,-,0.75Ck-Shandong-2567-09Negative-,-,0.75Vaccine5.230.435.750.43注：-代表没有分离到病毒2.2 27株H9N2流感病毒接毒对BALB/c小鼠的影响27株病毒接毒小鼠后，小鼠的体重在接下的14天中总体处于增长状态，没有一只小鼠死亡，小鼠表现精神状态良好，没有怕冷、被毛逆立饮欲食欲持续恶化等现象出现。没有病毒能引起小鼠体重的持续下降，没有病毒能够使小鼠的体重降至接毒时小鼠的体重。根据27株病毒接毒小鼠后在48天对小鼠体重影响方面，可以将病毒划分为3种类型：第一类有9株病毒，包括Ck-Jiangsu-825-09、Ck-Jiangsu-925-09、Ck-Guangdong-1351-09、Ck-Guangdong-1494-09、Ck-Guangdong-1683-09、Dk-Fujian-1753-09、Ck-Hunan-2230-09、Ck-Shanghai-4-06和Ck-Shanghai-340-09，其中以Ck-Hunan-2230-09为代表株，表现为小鼠接毒后体重持续增加，没有对小鼠体重增长造成任何的影响。第二类有15株病毒，包括Ck-Guangdong-1214-09、Ck-Guangdong-1258-09、Ck-Hunan-2106-09、Ck-Shanghai-2-04、Ck-Jilin-3-09、Ck-Shanghai-50-09、Ck-Shanghai-96-09、Ck-Shanghai-169-09、Ck-Shanghai-441-09、Ck-Shanghai-510-09、Ck-Hunan-2351-09 、Ck-Shandong-2552-09、Ck-Shandong-2567-09和Vaccine，其中以Ck-Guangdong-1214-09为代表株，表现为在接毒后在第48天体重增缓或稍有下降，之后体重重新恢复增长。第三类有3株病毒，包括Ck-Shanghai-1-06、Ck-Shanghai-5-03和Ck-Shanghai-6-03，其中以Ck-Shanghai-1-06为代表株，表现为在接毒后在第48天体重下降明显，但之后体重重新恢复增长。3类代表毒株的体重曲线见图1图1 H9N2流感病毒接毒后代表毒株体重的增长曲线3 讨论第4章 H9N2流感病毒分子进化分析1