【基金】2010CB833700-生物膜动态变化的分子机理与功能研究

项目名称：生物膜动态变化的分子机理与功能研究首席科学家：陈晔光 清华大学起止年限：2010年1月-2014年8月依托部门：教育部一、研究内容1. 关键科学问题本项目将重点围绕生物膜动态变化这一膜生物学研究的国际前沿领域，系统地开展生物膜动态变化分子机制的研究，并重点揭示生物膜动态变化在细胞信号转导、能量代谢、增殖分化、物质运输和循环利用等关键生命活动中的重要作用：（1）生物膜动态变化的分子机理细胞生命活动得以实现依赖于生物膜体系的动态特征：物质动态交换及自身的更新与重构。细胞内各种生物膜体系始终处于不断的形成、消失及重建过程之中。本项目将研究生物膜动态变化的分子机理，寻找调控其变化的关键蛋白质分子，研究蛋白质与蛋白质之间、蛋白质与膜脂之间相互作用关系，从细胞质膜、细胞器膜、核膜、细胞囊泡膜等方面阐明生物膜变化的分子机理。（2）生物膜动态变化在细胞生命活动中的作用生物膜在生命活动中承担着重要的作用，其动态变化过程将广泛地影响着细胞的各种功能。本项目将探索细胞囊泡膜与物质运输之间的关系、生物膜动态变化对信号转导的影响、核膜的动态变化对细胞增殖的影响、细胞器膜与能量代谢的关系以及生物膜与物质及细胞器的回收利用等相关膜生物学重点问题。2主要研究内容：（1）生物膜转运及其调控机制的研究致密核心囊泡是神经肽和激素转运的主要承担者，对其转运过程机制和调控的研究，相对于突触囊泡来言要少得多。我们将集中力量，主要研究以下方面的内容：I.通过对一种高度保守定位于高尔基体的膜蛋白的研究来探索致密核心囊泡囊泡生成（biogenesis）和成熟（maturation）机制；II.锚定和激活是囊泡融合前的关键步骤，转运囊泡与靶膜（包括细胞质膜和各细胞器膜）的特异性锚定是决定囊泡融合的时间、空间特异性和囊泡融合速率的重要因子，对其分子机制和调控的认识还远未清楚。我们将选择多种Rab蛋白及它们下游效应物蛋白，研究它们在囊泡锚定中的作用、作用机制及其这些分子的相互作用网络；III.从半融合（hemi-fusion）机制、决定囊泡膜融合的SNARE复合物解聚合和各SNARE蛋白的循环利用等方面展开，对溶酶体膜不稳定的分子机理进行研究。（2）生物膜形态发生及维持的分子机制我们将以内质网网膜的形态为侧重点，深入研究膜蛋白在塑造生物膜形态中的作用。具体包括：a).对有曲膜功能的成管膜蛋白的结构与功能进行探究。酵母细胞的成管膜蛋白Yop1p和Rtn1p，虽然能被大量提纯，但是很难被结晶，所以用X光衍射的方法解析其结构不可行。我们将从Yop1p蛋白入手，在不同位点引入半胱氨酸，通过二硫键的形成与否，来判断氨基酸的侧链是否邻近，从而来推测这些膜蛋白的大致构象，如穿膜螺旋的排列方式等。b).高等动物中的Atlastin-1蛋白及其酵母中的Seylp都是Dynamin家族中的嵌膜GTP酶，我们推测其可能参与内质网管状网络的形成，因此将对Dynamin家族嵌膜GTP 酶影响膜形态的机制进行研究。（3）生物膜组成成分的动态变化分析通过技术集成和条件优化建立由高分辨质谱、多维毛细管液相色谱、稳定同位素标记（如SILAC和iTRAQ等)和无标记等组成的，能够适合不同复杂程度的生物样品（如组织样本、细胞样本）的定量（膜）蛋白质组学技术平台。同时主要以生物膜和线粒体为样本，探索具有多次跨膜即高度疏水的膜蛋白和低丰度的膜蛋白质谱鉴定方法，提高膜蛋白的鉴定率。另外，我们将开展不同生理状态或生理过程（如发育、细胞分化）和不同病理状态下，生物膜动态变化过程中，主要膜蛋白、亚细胞器蛋白质组的表达水平的及其翻译后修饰的动态变化规律分析研究。开展II糖尿病发病机制的相关膜蛋白研究及肿瘤相关重要膜蛋白或抗原的研究。（4）生物膜的动态循环与自吞噬调控自吞噬在很多不同的细胞器的产生、消失和再生之间起着重要的作用。我们最近发现在吞噬溶酶体形成之后，溶酶体的膜成分可以通过在吞噬溶酶体上形成一个管状结构而得以回收利用，最后形成新的溶酶体，并发现这一过程受到mTOR激酶的调控。我们将系统、深入地对这一过程的分子机理进行研究，主要包括：筛选出调控自吞噬性溶酶体再生的新基因并研究其调控作用；用数学建模和系统生物学的方法探讨mTOR激酶、自吞噬及自吞噬降解产物的相互作用，阐释自吞噬的自我调控过程。最新的研究结果表明，损伤了的线粒体会被自吞噬体特异性的识别并降解。（5）核膜的动态变化与细胞增殖调控细胞核内外通过核孔复合体进行着广泛的物质信息交流。这种交流对细胞基因的表达直至整个细胞生命活动均起着重要的调控作用。高等生物的核膜在细胞周期中还呈现解聚和重新装配等动态变化。因此，我们将主要研究：Ran，nucleoplasmin和 importin-与核膜和核孔复合体的装配的关系；LBR（Lamin B Receptor）、核纤蛋白及其结合蛋白与核膜动态变化的关系；细胞核动态结构与功能调控；核膜动态变化、核膜物质运输与细胞增殖调控。（6）生物膜动态变化对信号转导的调控我们将重点围绕生物膜动态变化对细胞TGF和Wnt信号通路的调控。具体的问题包括：TGF信号通路受体及其他下游分子在细胞膜上的分布及其调控机制；脂筏在TGF信号转导特异性决定中的作用；受体内吞以及进一步在细胞内分选的分子机理；脂筏动态及囊泡内吞对各条通路信号输出的影响；细胞自吞噬对Wnt及TGF信号转导通路的影响；研究有关囊泡融合的分子机制等。膜融合对生物膜动态变化起着至关重要的作用，并参与调控多种复杂的生物学过程。不同类型生物膜之间融合的过程具有一定的共性，又有其各自的特点。因此，我们将以六个课题组的科研实力为依托，从不同的角度对本研究内容进行联合攻关。具体的问题包括：鉴定囊泡融合过程中关键蛋白的功能；探索吞噬溶体膜与溶酶体膜、质膜与肌质网膜、细胞核重组过程中核膜融合的机制；研究胞外信号与生物膜融合过程的相互影响。二、预期目标1、本项目的总体目标：本项目以开展膜生物学国际前沿研究为目标，围绕膜生物学研究中关键的科学问题生物膜动态变化的分子机理，聚焦于生物膜动态变化在细胞信号转导、能量代谢、增殖分化、物质运输和循环利用等关键生命活动中的重要作用，结合膜蛋白质组学，细胞器和膜蛋白离体重组等关键技术，系统地开展生物膜和膜蛋白领域的国际前沿基础研究。本项目将建立和培养一支具有国际领先水平的膜生物学研究队伍，在瞄准重大科学问题和世界前沿领域的基础上，密切结合我国的实际情况，争取进一步开创和完善我国膜生物学的实验研究体系，并基于多种模式生物建立一定规模的膜蛋白功能研究的平台，在生物膜的动态变化的分子机制与功能研究上取得若干突破。本项目将大大提升我国膜生物学研究的水平和国际影响力，使我国该领域在国际上占据重要的地位，并为我国基于膜蛋白药物靶点的创新药物研发奠定基础。2、五年预期目标：（1） 阐明致密核心囊泡运输过程中一系列膜动态的分子机制，探索包括内质网在内的细胞内膜精细结构形成和维持的关键机制和生理功能，揭示脂滴与线粒体之间的相互作用关系，以及这些相互作用对细胞能量代谢平衡的调控，揭示自吞噬性溶酶体再生以自吞噬性线粒体降解的分子机制，深入研究核膜融合以及核孔复合体装配的分子基础和机理，揭示生物膜动态变化对细胞TGF和Wnt信号通路的调控作用，鉴定一批新的膜蛋白和参与生物膜动态变化的调节分子，获得一批原创性的成果；（2） 在现有的基础上，建立完善的膜生物学和膜蛋白结构与功能研究的平台技术体系，重点加强膜蛋白在离体系统中的功能研究，以多种模式生物为基础建立具有特殊膜形态和膜动态的重要细胞器的分离纯化体系，进一步强化膜结构体外重装和膜蛋白与膜脂体外重组的关键技术，发展和完善膜蛋白质组学的研究平台，并争取实现若干关键技术的自主创新；（3） 阐述生物膜结构和功能的异常与发生人类重大疾病的相互关联，针对我国多发的癌症，糖尿病和神经退行性疾病种类，寻找一些以膜蛋白为基础的新药物靶点，获得一批有自主知识产权的研究成果；（4） 通过培养博士后和博士研究生，扶植一批在膜生物学和膜蛋白研究领域具有国际竞争力的优秀中青年科学家和后备人才，造就一支结构合理、具备攻坚能力的国际先进水平的研究队伍；（5） 以研究论文和独立开发的技术成果（专利）的形式公布项目研究成果，五年内争取发表SCI论文80篇，其中包括在影响因子大于5的SCI刊物上发表学术论文40篇左右，力争在国际顶级水平杂志上发表高水平论文，并申报专利2-3项。三、研究方案1、学术思路本项目拟依据膜生物学的国际前沿科学问题，选择若干重要方面，结合我们现有的研究基础来探索生物膜动态变化的分子机理，从蛋白质-蛋白质、蛋白质脂类相互作用，以及生物膜组成成分动态变化分析入手，在分子、细胞器和细胞等多层次上着重阐明生物膜动态变化过程中的分子机理和信号调控机制。生物膜动态变化过程中的分子机制是本项目的核心科学问题，涉及重要膜蛋白及复合体的功能研究，需要膜蛋白质组学发现并鉴定新的相关蛋白，也涉及膜脂与膜蛋白的相互作用机制。本项目将重点揭示生物膜动态变化与细胞信号转导、物质运输、能量代谢、细胞增殖分化、物质与细胞器回收利用等方面的关系及其相关分子机制，从六个不同的角度展开联合攻关：生物膜转运及其调控机制的研究（课题1），生物膜形态发生及维持的分子机制（课题2），生物膜组成成分的动态变化分析（课题3），生物膜的动态循环与自吞噬调控（课题4），核膜的动态变化与细胞增殖调控（课题5），生物膜动态变化对信号转导的调控（课题6）。2、技术途径(1) 本项目将采取多学科相互交叉、渗透和有机结合的途径，重点围绕生物膜动态变化、物质运输、膜脂与膜蛋白相互作用,蛋白与蛋白相互作用等膜生物学研究中关键的科学问题，结合膜蛋白质组学等关键技术，系统地开展生物膜和膜蛋白国际前沿领域的基础研究。(2) 在多种的空间尺度上研究细胞膜及膜蛋白的结构与功能,包括整体、细胞、细胞器、分子。在整体水平，将采用基因敲除鼠和转基因鼠线虫，及yeast研究细胞膜及膜蛋白的功能；在细胞水平研究生物膜的动态变化以及膜蛋白的定位、功能和相互作用网络等；在细胞器水平，研究膜结构形成、膜转运、细胞器相互作用；在分子水平，研究重要膜蛋白组成与功能的调控机理；膜脂质的组成，及膜脂质与膜蛋白的相互作用，在结构研究方面，确定膜蛋白复合体组成亚基的空间分布。(3) 稳态与动态研究相结合，在不同的时间尺度上研究膜及膜蛋白的功能与结构。应用皮秒、纳秒、微秒及毫秒等光谱技术，实时监控膜及膜蛋白的表现行为和相互作用的动力学特性；在不同的时间尺度上研究细胞器行为的动力学特性，包括形成、变化、运动及相互作用。(4) 离体(in vitro)和在体(in vivo)研究相结合。将研究的膜结构分离、纯化，重组进行离体功能研究。将研究的膜蛋白分离、纯化或者表达，重组到脂质体上进行离体功能研究，也要研究这些膜蛋白在动物或细胞活体中的功能，使离体与在体研究相统一。(5) 个体膜蛋白研究与膜蛋白质组学研究相结合。通过膜蛋白质组学系统地研究和发现重要功能的膜蛋白及膜蛋白复合物，再针对个体膜蛋白进行深入的功能与结构研究；或者基于对个体膜蛋白功能与结构的深入了解，研究蛋白与蛋白的相互作用，建立与之相互作用的蛋白质相互作用网络。(6) 功能与结构的研究紧密结合。膜蛋白功能的研究紧密围绕与囊泡运输、胞吞胞吐、核膜的动态变化、膜结构形成、细胞器相互作用、跨膜信号转导等重要细胞生命活动，膜蛋白结构的研究配合膜蛋白功能进行，膜蛋白功能调控的分子机理的阐明最终需要膜蛋白结构研究提供的结构信息，两者互相促进。3、创新点与特色(1)聚焦国际前沿科学问题是本项目的主要创新点。本项目的选题重点围绕生物膜动态变化与膜功能的相互调节这一关键科学问题，从两个不同方向和层次展开研究：一是探索生物膜动态变化的过程和机理；二是研究生物膜动态变化对细胞生命活动的影响。这两个方向的研究在国际上都处于发展阶段，很多具体的机制仍有待阐明，具有很大的创新空间。在本项目的几个具体研究内容，例如生物膜的转运、内膜精细的结构形成、内膜系统相互作用、细胞自吞噬、核膜动态变化、生物膜动态变化对细胞信号通路的调控等，也都是目前膜生物学领域乃至整个生命科学领域研究的热点和难点。因此，本项目的主要创新点就在于能够把握住国际研究的主流方向，针对关键的科学问题集中攻关，从而在这一充满机遇与挑战的领域取得重大突破；(2)多角度联合攻关和多研究手段综合运用是本项目的一大特色。本项目汇聚来自膜生物学、细胞生物学、生物物理学、分子生物学、化学、物理学、生物信息学等相关领域的优秀研究队伍，综合运用各种最新的技术手段，在多个时间和空间尺度上展开研究，力争从多个角度回答这个关键的科学问题。所设置的课题彼此渗透、紧密联系，可相互借鉴与补充，极大的有利于创新性研究成果的获取。4、可行性分析本项目的总体方案经我们团队成员反复论证之后，从以下三个方面分析确定了其可行性：首先，我们已有了良好的工作基础。我们团队在生物膜与膜蛋白的结构与功能的研究具备良好的基础。近年来，在973项目“生物膜和膜蛋白的结构与功能研究”（2004CB720000）的支持下，围绕着膜脂膜蛋白的相互作用、内膜转运分子机制及其调控研究、细胞信号转导、跨膜物质运送、膜蛋白三维结构的研究等方面都进行了深入系统的研究，取得了在国际上有重要影响的成果。其次，是人才队伍方面，承担本项目研究工作的中坚力量和学术骨干都是我国膜生物学、细胞生物学、分子生物学和生物物理学领域的学术带头人和技术骨干。本项目的研究队伍主要以中、青年科学家组成，多数都是从海外留学归来的成绩卓著的中青年科学家，拥有丰富的研究经验，多次在国际著名杂志和期刊上发表论文。第三，承担单位有良好的研究条件和研究基础。本项目研究主要以生物膜与膜生物工程国家重点实验室和生物大分子国家重点实验室为依托,有完成本项目的能力和所需的仪器设备条件。此外，中国科学院、清华大学、北京大学、南开大学等单位的大力支持也将保证本课题的顺利实施和圆满完成。5、课题设置课题1、生物膜转运及其调控机制的研究预期目标：采用高时空分辨的生物物理技术和其它研究方法，研究致密核心大囊泡的生成、成熟、与靶膜的拴系和锚定、激活、膜融合的机制及其调控，研究一些关键蛋白的功能、作用机制、结构与功能关系和膜不稳定的分子机理。研究内容：1致密核心囊泡囊泡生成（biogenesis）和成熟（maturation）机制研究。囊泡生成是囊泡物质转运活动的早期步骤，有内质网和高尔基体两个细胞器参与。就囊泡运输活动而言，包括转运囊泡从内质网出芽、转移到高尔基体、囊泡在高尔基体的拴系与锚定、最后与高尔基体顺面的膜融合、新的囊泡在高尔基体反面网络结构出芽。该过程有两次膜出芽形成囊泡和一次囊泡融合过程。对其认识主要来源于形态学研究，对其机制的研究甚少。我们的初步工作发现，一种高度保守定位于高尔基体的膜蛋白参与了致密核心囊泡的生成过程，但该蛋白的结构、作用机制、与其相互作用的蛋白、是否接受调控及可能的调控机制等关键问题均不清楚，亟待解决。本课题的研究目标之一是回答这些科学问题。2致密核心囊泡锚定（docking）和激活（priming）机制及其调控研究。锚定和激活是囊泡融合前的关键步骤，转运囊泡与靶膜（包括细胞质膜和各细胞器膜）的特异性锚定是决定囊泡融合的时间、空间特异性和囊泡融合速率的重要因子，对其分子机制和调控的认识还远未清楚。我们将选择多种Rab蛋白及它们下游效应物蛋白，研究它们在囊泡锚定中的作用、作用机制及其这些分子的功能相互作用网络；另外，我们发表在Neuron杂志上的工作证明CAPS/Unc31参与了囊泡锚定过程。今后我们将继续研究该蛋白的结构与功能关系，研究其作用机制。3溶酶体膜不稳定的分子机理：溶酶体中存在一种丝氨酸蛋白酶chymotrypsin B，它可参与到细胞凋亡信号通路中。我们过去的研究证实了chymotrypsin B能调控TNF跨膜信号通路。今后我们将进一步探索以下问题：比较TNF-跨膜信号通路与胞内信号通路诱发细胞凋亡过程中chymotrypsin B的不同作用；通过膜脂-膜蛋白，膜蛋白-膜蛋白相互作用研究溶酶体膜不稳定的分子机理，并与线粒体外膜不稳定相比较；chymotrypsin B从溶酶体释放后，与胞内各种膜系的直接或间接相互作用等。承担单位：中国科学院生物物理研究所、华中科技大学、生物大分子国家重点实验室课题负责人：徐涛学术骨干：卫涛涛、吴政星、赵雪燕经费比例：22.63%课题2、生物膜形态发生及维持的分子机制预期目标：生物膜各种形态的发生及维持是膜动态变化的分子基础。我们将以内质网，包括肌质网的结构为重点，系统研究细胞内膜精细结构形成和维持的关键机制，并深入探索膜结构之间的偶联机制，最终为阐述相关的重要细胞功能提供新的理论基础。研究内容：内质网管状网络形成的机制：我们将从酵母成管膜蛋白Yop1p蛋白入手，在不同位点引入半胱氨酸，通过二硫键的形成与否，来判断氨基酸的侧链是否邻近，从而来推测这些膜蛋白的大致构象，如穿膜螺旋的排列方式等。我们也将使用同一方法进一步推测成管膜蛋白的多聚化结合位点。将以高等动物细胞和酵母细胞为系统，首先测试Atlastin蛋白家族以及酵母中的Sey1p在内质网的定位，并寻找鉴定与他们相互作用的蛋白。然后将通过突变体的过表达或野生型的敲除来观测不同细胞中内质网形态的变化。将纯化这些蛋白，深入研究GTP水解活性以及多聚化的分子机制，并把纯化的GTP酶应用到管状结构的体外重组中，来测试这些GTPase对内质网网络的具体作用机制。承担单位：南开大学课题负责人：胡俊杰学术骨干：田俊英经费比例：12.11%课题3、生物膜组成成分的动态变化分析预期目标：我们将以定量膜蛋白质组学技术为主要技术手段，以细胞质膜、线粒体、内质网、脂滴等亚细胞器为研究对象，研究生物膜组成成分动态变化规律，如重要蛋白质的表达水平的及其翻译后修饰的动态变化规律。揭示脂滴与内质网和线粒体之间的相互作用关系，以及这些相互作用如何调控细胞能量代谢平衡。研究内容：1通过技术集成和条件优化建立由高分辨质谱、多维毛细管液相色谱、稳定同位素标记（如SILAC和iTRAQ等)和无标记等组成的，能够适合不同复杂程度的生物样品（如组织样本、细胞样本）的定量（膜）蛋白质组学技术平台。同时主要以生物膜和线粒体为样本，探索具有多次跨膜即高度疏水的膜蛋白和低丰度的膜蛋白质谱鉴定方法，提高膜蛋白的鉴定率。2开展不同生理状态或生理过程（如发育、细胞分化）和不同病理状态下，生物膜动态变化过程中，主要膜蛋白、亚细胞器蛋白质组的表达水平的及其翻译后修饰的动态变化规律分析研究。开展II糖尿病发病机制的相关膜蛋白研究及肿瘤相关重要膜蛋白或抗原的研究。承担单位：中国科学院生物物理研究所课题负责人：杨福全学术骨干：谢振声、薛鹏、蔡潭溪经费比例：12.11%课题4、生物膜的动态循环与自吞噬调控预期目标：自吞噬参与许多细胞器命运的调控，本课题通过对自吞噬性溶酶体再生和自吞噬型线粒体降解的分子机制的研究，提出并验证自吞噬过程中不同细胞器膜系之间的识别、融合、分选，再生的模型和调控机制，揭示他们在细胞能量代谢，细胞凋亡中的作用，并探讨它们在癌症和神经退行性疾病中所起的作用。研究内容：利用自动高通量活细胞显微成像,结合RNAi干扰文库，筛选参与自吞噬性溶酶体再生的新基因；通过细胞和生物学和生物化学的手段对这些基因的功能进行研究；研究自吞噬性溶酶体再生在细胞代谢和细胞程序性死亡中的作用，并探讨这一过程在癌症，神经退行性疾病中的作用；并用数学建模和系统生物学的方法探讨细胞的物质和能量代谢同自吞噬性溶酶体再生的耦联关系，并重点探讨mTOR 激酶在这一自我调控过程中的作用。 承担单位：清华大学课题负责人：俞立经费比例：9.47%课题5、核膜的动态变化与细胞增殖调控预期目标：在前一期973课题的支持下，我们的工作取得了重要进展，如发现Importin-参与核膜膜泡的募集等。在本课题中，我们将进一步围绕核膜动态变化及核膜功能研究中关键的科学问题，深入探讨核膜重建的分子机理，主要聚焦于核膜膜泡的募集、融合以及核孔复合体装配的分子机制，在核膜重建机理等研究上取得若干突破。研究内容：1Ran，nucleoplasmin和 importin-与核膜和核孔复合体的装配。我们以往的工作显示，importin-在Ran的调控下参与核膜重建。偶联了importin-蛋白的琼脂糖小球能够在爪蟾卵提取物中诱导核膜重建，但是它在围绕着染色质进行的核膜重建中的功能一直不清楚，关于importin-在核膜重建中的调控作用至少还有以下问题需要解决：1）膜泡和核孔蛋白是如何通过importin-富集到染色质周围的。2）Importin-通过与哪些因子的相互作用富集并结合到染色质上。3）importin-与核孔蛋白的直接结合对核孔复合体装配是否有促进作用，以及在装配过程中核孔蛋白何时与importin-解离，是核孔蛋白先从importin-上解离下来才能装配成核孔复合体还是核孔复合体装配完成之后再解离。4）Ran在这个过程中是如何进行时空上的调控的。今后的研究中，我们还将侧重于研究nucleoplasmin和importin-/在核膜重建过程中的蛋白质相互作用及其在核膜重建过程中的功能。2LBR（Lamin B Receptor）、核纤蛋白及其结合蛋白与核膜动态变化。我们近期的工作发现，LBR在Ran和importin 的调控下，在核膜动态变化过程中起着非常重要的调控作用（Ma et al., JCS, 2007）。我们将进一步深入地探讨LBR在核膜的动态过程中的功能。主要侧重于探讨磷酸化对LBR参与核膜动态变化的调控；探讨importin 和LBR的相互作用与核膜动态变化；寻找参与调控该过程的其它调控因子。我们还拟研究Lamin以及结合蛋白在与核膜动态变化、染色质的修饰和染色质高级结构变化以及NPC（核孔复合体）在核膜上空间分布等的关系。3细胞核动态结构与功能调控。有报道称HP1（heterochromatin protein 1）参与细胞核重建过程。在细胞核重建过程中，HP1有由游离状态重现结合到染色体（质）上。HP1可以直接与LBR结合。我们希望进一步研究PH1在核膜重建中的功能。此外，我们近期发现HP1与nucleophosmin(B23)可以直接结合。为此，我们希望进一步了解HP1在核膜动态变化、细胞核功能调控中的作用。我们的另一个工作重点还包括研究核膜对DNA复制因子转位的调控。4核膜动态变化、核膜物质运输与细胞增殖调控。近来的研究表明Crm1在中心体和动粒上都有定位，并且对中心体和动粒的结构和功能都有调节作用，进而影响细胞周期中纺锤体的装配以及细胞周期的进展。因此，我们的研究将Crm1的核运输功能和调节中心体和动粒的功能联系在一起。我们还发现中心体上的结构性蛋白pericentrin的序列中含有核外运输信号，并且pericentrin的核外运输依赖于Crm1。因此我们将研究下面的问题：1）Crm1调节pericentrin核外运输的功能与pericentrin在中心体上的功能是如何联系的？2）Crm1在调节pericentrin核外运输的同时，调节中心体的哪方面功能以及具体的调节机制。3）Crm1在间期参与核运输，在分裂期参与调节纺锤体的结构和功能，Crm1在不同时期的两个截然不同功能是否涉及到Crm1的修饰，例如磷酸化。4）我们还计划寻找受Crm1调节的核外运输蛋白，尤其是动粒蛋白。承担单位：北京大学课题负责人：张传茂学术骨干：滕俊琳经费比例：14.2%课题6、生物膜动态变化对信号转导的调控预期目标：我们将在动物、细胞和分子水平上研究细胞膜动态变化对细胞增殖和凋亡有关信号转导的调控模式，阐明其中重要蛋白的功能与结构基础，鉴定一批新的参与生物膜动态变化的调节分子，探讨有关囊泡融合的分子机制。研究内容：1生物膜脂筏结构对TGF信号转导的调控作用：生物膜脂筏是生物膜上富含胆固醇和鞘磷脂的特化区域，对生物体的许多信号转导通路都有重要的调节功能。我们发现TGF受体在脂筏区域内的分布情况可能受很多复杂因素的调控，但具体机制尚不清楚。我们希望能进一步探索TGF受体进出脂筏的机制、受体脂筏定位对于TGF信号转导的影响及其分子机理。2TGF受体分选和降解途径的调控：一般认为，受体的降解在一定程度上依赖于受体的泛素化修饰过程。根据现有的实验结果，我们推测泛素化修饰后的TGF受体可以被分选进入不同的亚细胞结构来完成降解或重新利用。我们鉴定了Dapper2蛋白，发现它具有促进TGF受体降解、抑制TGF信号的功能。然而，对于Dapper2促进受体降解的具体机制，以及Dapper2是否参与受体分选进入不同细胞器的过程，目前都不清楚。我们将进行大规模的Dapper2相互作用蛋白的筛选工作，探索它们与Dapper2一起如何控制TGF受体在细胞内的分选、促进受体降解的机制。3细胞自吞噬(autophagy)与信号转导的相互调节：自吞噬是细胞利用溶酶体降解自身受损的细胞器和大分子物质的过程。我们发现细胞可以利用自噬这一方式抑制Wnt信号通路，暗示自吞噬可能是一种新的调控信号转导的方式。我们将研究这一过程的分子机制以及信号转导与自噬的相互调节等。4囊泡融合的分子机制：囊泡与靶膜的融合是囊泡物质转运的最后步骤，尽管对参与囊泡融合及对融合孔动力学调控的蛋白已有较多的了解，但仍有许多关键问题有待解决。囊泡融合的完成要经历半融合（hemi-fusion）状态、融合孔（fusion pore）的形成和扩张等中间步骤。融合完成后，在融合过程中起关键作用的SNARE复合体将被解聚，以便循环利用。而目前对这些中间过程机制的认识还很少。本课题将就半融合（hemi-fusion）机制、决定囊泡膜融合的SNARE复合物解聚和各SNARE蛋白的循环利用等问题开展深入研究。承担单位：清华大学课题负责人：陈晔光学术骨干：隋森芳经费比例：29.48%四、年度计划研究内容预期目标第一年1. 我们前期973项目发现了一个新的调控致密核心囊泡分泌的蛋白，在此基础上将继续研究该蛋白的功能和机制。2. 测试通过二硫键的形成来推测膜蛋白大致构象的可行性；分析酵母膜蛋白Yop1p引入半胱氨酸的最佳位点。3. 进一步完善现有的高通量、高灵敏度的膜蛋白质组学技术方法、膜蛋白复合体的分析鉴定技术方法、以及高通量和高灵敏度磷酸化蛋白质组学技术方法；以线虫为模式生物，纯化线粒体，进行蛋白质组学分析；初步建立由高分辨质谱、多维毛细管液相色谱、稳定同位素标记（如SILAC、iTRAQ等)以及非标记技术组成的定量（膜）蛋白质组学技术平台。该平台能够适合不同复杂程度的生物样品中蛋白质的定量分析；初步建立2D-LC-MS/MS和MDSM-SL脂质组学技术方法。4. 利用自动高通量活细胞显微成像, 结合RNAi干扰文库， 筛选参与自吞噬性溶酶体再生的新基因。5. 深入探讨Ran，nucleoplasmin和 importin-与核膜和核孔复合体的装配的机理，开展CRM1和Pericentrin在核膜内外物质运输及其与细胞增殖调控的关系研究。6. 研究细胞自吞噬与信号转导相互调节，了解自吞噬对Wnt信号转导的调控作用及其分子机制；在大规模酵母双杂交的基础上，进一步验证各种靶蛋白与Dapper2蛋白相互作用的真实性，并初步筛选其中可能与内吞或者TGF-信号调控相关的蛋白；构建NSF、SNAP和SNARE单体蛋白的质粒，分离纯化蛋白，并进行NSF解聚SNARE复合体的功能实验。1. 确定该蛋白的作用位点和作用机制。2. 建立芽殖酵母遗传操作与生化测试的技术平台；建立针对成管膜蛋白分子内或分子间二硫键形成的检测系统。3. 完成大鼠L6骨骼肌细胞磷酸化蛋白质组学分析；完成线虫线粒体蛋白质表达谱的分析；初步建成定量（膜）蛋白质组学技术平台。完成线虫线粒体蛋白质表达谱分析；建立生物样本中总脂的提取方法，以及不同种类脂质分子的分类提取方法，并建立2D-LC-MS/MS和MDSM-SL脂质组学技术方法。4. 鉴定一批参与自吞噬性溶酶体再生的新基因。5. 主要解决膜泡和核孔蛋白是如何通过importin-富集到染色质周围的。6. 了解自吞噬Wnt信号或者TGF-信号的相互调节，阐明自吞噬对Wnt信号转导的调控作用及其分子机制；初步筛选与Dpr2相互作用的蛋白及其可能在内吞与TGF-信号调控中的作用；证明纯化的NSF、SNAP和SNARE等蛋白是有功能的，方便以后蛋白结构方面的研究。第二年1. 动态跟踪致密核心囊泡在活细胞中的循环过程，确定其轨迹和动力学特性。2. 系统测试Yop1p不同位点间二硫键形成的情况；纯化成管膜蛋白及其相关的嵌膜GTP酶。3. 完善定量（膜）蛋白质组学技术平台，开展线粒体相关定量蛋白质组学应用研究；完善脂质组学技术，开展线虫线粒体的脂质组学研究。4. 通过细胞生物学和生物化学的手段研究新基因在自吞噬性溶酶体再生中的作用；用数学建模和系统生物学的方法探讨细胞的物质和能量代谢同自吞噬性溶酶体再生的耦联关系，并重点探讨mTOR 激酶在这一自我调控过程中的作用。5. 继续深入探讨Ran，nucleoplasmin和 importin-与核膜和核孔复合体的装配的机理，探讨LBR（Lamin B Receptor）、核纤蛋白及其结合蛋白与核膜动态变化的关系。6. 研究自吞噬对Wnt信号调控在细胞生长与增殖，肿瘤形成以及动物早期胚胎发育中的意义；挑选1-2个与Dapper2相互作用蛋白进行深入的研究，了解其与Dpr2蛋白的相互关系及功能联系，研究它们在受体内吞或者TGF-信号调控中的作用与分子机制；进一步进行NSF解聚SNARE复合体的功能实验。1. 揭示致密核心囊泡从生成、转运、成熟、分泌、内吞和回收的各步骤及其动力学特性。2. 有二硫键形成图谱推测Yop1p的蛋白构象及多聚化的分子基础，并预期在细胞内验证重要位点的功能；建立用芽殖酵母表达纯化膜蛋白的体系，摸清这些膜蛋白与膜脂体外重组的条件。3. 完成高糖处理前后大鼠INS-1b细胞线粒体蛋白质表达水平变化研究；鉴定与分析线虫线粒体中脂质的基本组成。4. 初步了解鉴定出来的基因在自吞噬性溶酶体再生的作用，同时对细胞的物质和能量代谢同自吞噬性溶酶体再生之间的耦联关系建立数学模型。5. 重点解决Importin-通过与哪些因子的相互作用将膜泡富集并结合到染色质上；了解参与调控LBR功能的部分调控因子。6. 了解自吞噬对Wnt信号调控的功能意义；寻找与受体内吞和降解相关的新蛋白并阐明其作用机制；了解NSF解聚SNARE复合体的机制。第三年1. 利用线虫反向遗传学的优势开展致密核心囊泡相关基因的大规模筛选工作。2. 研究Atlastin蛋白家族以及Sey1p在内质网的定位特点；寻找到Atlastin等嵌膜GTP酶在细胞内的主要结合对象。3. 以线虫为模式生物，利用建立的定量蛋白质组学技术方法，研究不同生理、病理条件下的线虫线粒体蛋白的动态变化；初步探讨定量脂质组学技术方法及其应用研究。4. 通过细胞生物学和生物化学的手段研究新基因在自吞噬性溶酶体再生的作用；研究自吞噬性溶酶体再生在细胞代谢和细胞程序性死亡中的作用；探讨自吞噬性溶酶体生成在癌症，神经退行性疾病中的作用。5. 研究importin-与核孔蛋白的相互作用和核孔复合体装配；Ran在这个过程中是如何进行时空上的调控的。我们还将侧重于研究nucleoplasmin和importin-/在核膜重建过程中的蛋白质相互作用及其在核膜重建过程中的功能；探讨LBR（Lamin B Receptor）、核纤蛋白及其结合蛋白与核膜动态变化的关系。6. 进一步研究与Dapper2相互作用的蛋白的功能意义；研究TGF-受体在细胞膜不同区域的分布，探索TGF受体进出脂筏的机制、受体脂筏定位对于TGF信号转导的影响及其分子机理；通过负染电镜技术和冰冻电镜技术等生物化学和生物物理技术研究研究NSF在四种不同核酸状态的结构。1. 力争找到新的调控致密核心囊泡分泌的相关蛋白。2. 验证Atlastin蛋白家族在管状内质网的定位；确认Atlastin与成管膜蛋白的相互作用。3. 揭示线虫不同生理、病理条件下线粒体蛋白的动态变化；初步建立线虫线粒体定量脂质组学方法。4. 进一步深入了解新基因在自吞噬性溶酶体再生的作用；建立一种研究自吞噬性溶酶体再生在神经发育和功能维持的动物模型，用以深入研究高等动物中自吞噬对神经发育和功能维持的分子和细胞生物学机制。5. 深入了解importin-与核孔蛋白的直接结合对核孔复合体装配是否有促进作用，以及在装配过程中核孔蛋白何时与importin-解离，是核孔蛋白先从importin-上解离下来才能装配成核孔复合体还是核孔复合体装配完成之后再解离；了解Ra