生药的有效性评价.ppt

生药的有效性评价 Efficacyevaluationofcrudedrug Whichmethodscouldbeusedforefficacyevaluation How 生药的有效性评价 Efficacyevaluation 生物检定法 Bioassay 与疗效相关联的化学成分分析法 Analysisofbioactivecomponents 生药的生物效应评价法 定义 它以药物的药理作用为基础 生物统计为工具 运用特定的实验设计 在严格控制的试验条件下 通过比较标准品和供试品对生物体或离体器官与组织的特定生物效应 计算供试品的效价 Potency 或者毒性 Toxicity 从而控制和评价供试品质量或活性 生药的有效性评价方法之一 对一些采用理化方法不能测定含量或理化测定不能反映临床生物活性的药物 如胰岛素 肝素 缩宫素及各种抗生素等 微量生理活性物质 如Ach 5 HT某些有害杂质的限度检查如农药残留量 内毒素等致热物质 抗生素及生化制剂中降压物质的限度检查等 应用范围 中药及复方 中药成分复杂 大部分中药的有效成分尚未搞清 难以用理化方法加以控制 但可用一些以其疗效为基础的生物测定方法来控制其质量 应用范围 Example1洋地黄生物检定法 比较洋地黄标准品 S 与供试品 T 对鸽的最小公斤致死量 从而测定供试品的效价 死亡前有强烈颤抖 恶心呕吐 排便等反应 最后至瞳孔放大 呼吸停止为注射终点 抗凝血酶活性测定法 水蛭提取物 牛纤维蛋白原 凝血酶 滴定 至有凝固物出现 Example2水蛭抗凝血酶活性测定 淀粉酶活力测定法 麦芽提取物 淀粉 反应 反应终止 麦芽糖 Example3麦芽中淀粉酶活力测定 a b淀粉酶 底物 3 5 二硝基水杨酸 棕红色 540nm 生药化学成分分析法 生药的有效性评价方法之二 定义 应用范围 两种评价方法的比较 生物检定法 理化分析法 测定结果能直接反映药物的效价 是理化分析法的有力补充 测定结果误差较大 重现性较差 加上测定费时 计算繁琐 难以构建合适的药理模型以反映中药整体作用的特点 测定结果重现性好 易于控制与推广 测定结果与活性之间的相关性差 Methods Advantages Disadvantages 一 紫外 可见分光光度法 Ultraviolet visiblespectrometry 朗伯 比尔定律 A ECL 1 原理 单色光辐射穿过被测物质溶液时 被该物质吸收的量与该物质的浓度和液层的厚度成正比 双光束扫描扫描范围 190nm 800nm常量池 3ml 和微量池 50 120ul 配置UVProbo软件操作系统在操作系统控制下 可完成紫外可见光谱扫描 动力学测定 单波长和多波长的定量分析 数据图形处理以及规范化报告生成 岛津2450型紫外可见分光光度计 2 仪器 3 紫外 可见分光光度法定量方法 对照品比较法吸收系数法标准曲线法 适用对象 生药中大类成分的含量测定 如总黄酮 总蒽醌 总生物碱等 4 应用槐花 米 中总黄酮的比色法测定 药材提取物 亚硝酸钠 硝酸铝 氢氧化钠 500nm处测定 平贝母中总生物碱的含量测定 酸性染料比色法 药材 总生物碱 pH5 溴百里香酚蓝 比色法测定 412nm 二 色谱法 Chromatography 薄层色谱法 thinlayerchromatography TLC 气相色谱法 gaschromatography GC 高效液相色谱法 highperformanceliquidchromatography HPLC 一 薄层色谱法 thinlayerchromatography TLC 薄层板 plate 点样 loading 展开 developing 显色与检视 visualization detection 记录 recording 1 TLC一般操作程序 在计算机控制下 可自动完成点样 展开 显色 扫描 照像 彩色图片输出等一整套工作程序 瑞士CAMAG薄层色谱扫描仪 2 TLC仪器 中国药典 2010年版 一部薄层色谱法用于定性鉴别的达2000多项 多用于鉴别 限量检查 3 TLC的应用 斑点颜色 Rf值 依据 简便 快速 适应性广 可操作性强 优势 薄层扫描法定量 TLCS 3 TLC的应用 定量分析 酸枣仁中酸枣仁皂苷A B的TLCS法测定 3 TLC的应用 定量分析 薄层色谱 紫外可见分光光度法定量 TLC UV 点样 展开 定位 刮板 洗脱 UV测定 二 高效液相色谱法 highperformanceliquidchromatography HPLC 1 HPLC仪 Agilent1100SeriesHPLCSystems 硅胶 正相色谱化学键合硅胶 反相色谱离子交换填充剂 离子交换色谱凝胶 分子排阻色谱手性键合填充剂 对映异构体拆分 色谱柱 2 HPLC仪组成 紫外检测器 ultravioletdetector UVD 二极管阵列检测器 diodearraydetector DAD 荧光检测器 fluorescencedetector FLD 电化学检测器 electrochemicaldetector ECD 选择性检测器 检测器 2 HPLC仪组成 示差折光检测器 refractiveindexdetector RID 蒸发光散射检测器 evaporativelight scatteringdetector ELSD 质谱检测器 massspectrometricaldetector MSD 通用型检测器 检测器 2 HPLC仪组成 Alltech2000蒸发光散射检测器 Agilent液质联用仪 3 HPLC定性方法 三个定性参数 tR值 UV MS 内标校正因子法 外标法 面积归一化法 纯度检测 中国药典 2010年版 一部应用HPLC法测定含量的中药品种达1700余项 HPLC优势 4 HPLC定量方法 5 HPLC的应用 7 epi loganin 1 sweroside 2 loganin 3 7 epi vogeloside 4 secoxyloganin 5 1 金丝桃苷 2 异槲皮苷 1 金丝桃苷 2 异槲皮苷 1 金丝桃苷 2 异槲皮苷 UPLC的原理 vanDeemter方程 UPLC的优势 高分离度高速度高灵敏度 AgilentRRLC ShimadzuUFLC Agilent6890N型气相色谱仪 三 气相色谱法 Gaschromatography GC 1 GC仪 载气 H2 N2 He进样系统 溶液直接进样或顶空进样色谱柱 弹性石英毛细管柱柱温箱 恒温和程序升温检测器 2 GC仪组成 弹性石英毛细管柱不锈钢填充柱 涂壁毛细管柱 载体涂层毛细管柱 2 GC仪组成 色谱柱 检测器 火焰离子化检测器 flameionizationdetector FID 热导检测器 thermalconductivitydetector TCD 氮磷检测器 nitrogen phosphorusdetector NPD 火焰光度检测器 flamephotometricdetector FPD 电子捕获检测器 electroncapturedetector ECD 质谱检测器 massspectrometricdetector MSD 2 GC仪组成 3 GC定性方法 两个定性参数 tR值 MS 4 GC定量方法 内标校正因子法外标法面积归一化法标准溶液加入法 中国药典 2010年版 气相色谱法用于中药分析的品种有50余种 5 GC法的应用 Pogostemoncablin中patchoulialcohol pogostone的测定 高效毛细管电泳 highperformancecapillaryelectrophoresis HPCE 毛细管电色谱 capillaryelectrochromatography CEC 液相色谱与核磁共振联用 LC NMR LC NMR MS 四 其他色谱法 Miscellaneouschromatography HPCE HPLC MS 三 定量分析方法的方法学验证 Validationoftheanalyticalmethod 目的 证明采用的分析方法适合于相应检测要求 方法验证用于 建立新的分析方法时原分析方法进行修订时 一 验证内容 线性及范围 linearityandrange 准确度 accuracy 专属性 specificity 精密度 precision 重复性 repeatability 重现性 reproducibility 检测限及定量限 limitofdetectionandquantification 耐用性 robustness 1 线性 linearity 和范围 range 线性是指在设计的范围内 测试结果与试样中被测物质浓度直接呈正比关系的程度 范围系指能达到一定精密度 准确度和线性 测试方法适用的高低限浓度或量的区间 二 实验设计 线性 linearity 和范围 range Verticine8 1Y 0 0945X 0 04370 9981 0 27 4 AnalytestRCalibrationcurver2testrangemg ml Verticinone9 1Y 0 1006X 0 10360 9980 9 23 7 线性 linearity 和范围 range 2 准确度 accuracy 准确度系指用该方法测定的结果与真实值或参考值接近的程度 一般用回收率 表示 回收率 实测值 供试品所含被测成分量 加入对照品量 准确度 accuracy 加样回收率 准确度 accuracy 加样回收率 3 专属性 specificity 专属性系指在其他成分可能存在时 采用的方法能正确测定出被测物的特性 专属性常用的试验方法 空白阴性对照试验比较同一分析系统对照品与供试品相应色谱峰的吸收光谱色谱 质谱联用验证待测成分 2005年版中国药典分离条件下木犀草苷与忍冬苷共流出 对照品 对照品 金银花中忍冬苷 MW594 和木犀草苷 MW448 提取离子流图 忍冬苷 木犀草苷 MW594 MW448 新方法 2010年版中国药典 对照品的分离图 忍冬苷 木犀草苷 对照品 样品 UV MS UV MS 采用HPLC DAD MS联用技术 测定待测色谱峰的紫外吸收光谱及质谱来判断色谱峰的纯度 确保分析方法的专属性 4 精密度 precision 精密度是指在规定的测试条件下 同一个均匀供试品 经多次取样测定所得结果之间接近的程度 精密度通常包括以下三个方面的含义 重复性 repeatability 批内精密度 intra assayprecision 中间精密度 intermediateprecision 重现性 reproducibility 中间精密度表示方法 日内精密度 intra dayvariability 日间精密度 inter dayvariability 重复性 repeatability 重复性是指在同一条件下对同一批样品 从样品供试品制备开始 制备至少六份以上供试品溶液 即n 6 或设计3个不同浓度 每个浓度各分别制备3份供试溶液 进行测定 计算其含量的平均值和相对标准偏差 RSD 重现性 reproducibility 重现性是指在不同的实验室由不同分析人员测定结果的精密度 当分析方法将被法定标准采用时应进行重现性实验 3批月季花样品中金丝桃苷 异槲皮苷的含量 表明方法重现性良好 5 检测限及定量限 limitofdetectionandquantification 检测限是指试样中被测物质能被检测出的最低浓度或量 定量限是指样品中被测物质能被定量测定的最低量 6 耐用性 robustness 耐用性系指在测定条