拉曼光谱及其生物学应用.docx

拉曼光谱及其生物学应用朱加旺 20105450一、拉曼光谱1、 拉曼光谱基本原理：拉曼散射属于光的散射，单色光子与分子发生相互作用且发生非弹性碰撞时，二者之间有能量交换，此时，光子不仅要改变运动方向，而且频率也会发生改变，这种散射称为拉曼散射。在这种散射中，光子一部分能量转移到分子中，或者分子的振动和转动能量传递给了光子，从而改变光子频率。2、 拉曼光谱的解释及研究意义2.1 以经典理论解释拉曼散射时,认为分子以固有频率vi振动，极化率（见电极化率）也以vi为频率作周期性变化，在频率为v0的入射光作用下，v0与vi两种频率的耦合产生了v0、v0+vi和v0-vi3种频率。频率为v0的光即瑞利散射光，后两种频率对应拉曼散射谱线。拉曼散射的完善解释需用量子力学理论，不仅可解释散射光的频率差，还可解决强度和偏振等一类问题。2.1.1特征拉曼频率：拉曼光谱中的振动频率是由原子团和化学键确定的，我们称之为特征拉曼频率。分子振动时，键长和键角要同时发生双变，当分子中的某个集团与分子中与其邻近的基团无耦合作用时，其振动的频率和强度所反映的就是该基团独有的特征。由于分子是一个整体，其内部任何基团的振动都不可能完全独立的，手工同化学环境的影响，任意基团的振动频率都会发生微小的位移，这种频率位移的大小和方向就是基团化学环境变化的证据。因此，我们根据特征频率及其位移即可判定各种基团的存在与否及其化学环境的变化情况。特征拉曼频率在拉曼光谱分析中非常有用，现已总结出各类化学物的特征拉曼频率表，以供我们需要是比对和查找。2.1.2共振拉曼散射：当一个化合物被入射光激发且及发现的频率处于该化合物的电子吸收谱带以内时，由于电子跃迁和分子振动的耦合，会使得某些拉曼普线的强度陡然增加，这个现象被称为共振拉曼散射。2.1.3表面增强拉曼散射：当物质分子吸附在一些特定的金属表面时，分子的拉曼散射强度得到大大提升。表面增强拉曼散射有如下特点：SERS具有很强的增强因子；SERS具有金属选择性，出现SERS现象的金属材料只有少数几种，分别是币族金属金，银，铜；碱性金属锂，钠，钾；部分过度金属铁，钴，镍；SERS要求金属表面有一定粗糙度，不同金属出现最大SERS效应的粗糙度不一样。关于SERS的增强机理目前提出了两大类理论模型：物理增强模型和化学增强模型。物理增强模型认为SERS效应起源于金属表面局域电场的增强（又成为电磁增强）金属基底和被吸附分子之间的相互作用相对较弱。表面等离子模型，天线共振子模型和镜像场模型等均属于物理增强机制，但他们对于导致居于电磁场增强的原因的解释是不用的。化学增强模型认为，拉曼散射信号的增强是由于吸附在粗糙金属表面的物质分子极化率改变而引起的。主要的理论模型有货为模型和电荷转移膜性。因此，对于这两大增强机制的应用需要根据具体情况做具体分析，而且在大多数情况下往往可能是两种机制同时其作用。2.2意义：拉曼散射为研究晶体或分子的结构提供了重要手段，在光谱学中形成了拉曼光谱学的一分支。用拉曼散射的方法可迅速定出分子振动的固有频率，并可决定分子的对称性、分子内部的作用力等。自激光问世以后，关于激光的拉曼散射的研究得到了迅速发展，强激光引起的非线性效应导致了新的拉曼散射现象。二、 蛋白质的拉曼光谱从蛋白质的拉曼光谱可以同时得到许多可贵信息。分析蛋白质的拉曼光谱，不紧能够得到有关的芳香族组成氨基酸的信息，而且还能进一步得到二级结构的信息，包括定量估计。不但能够得知主链构象，特别是氨基酸I、III、C-C、C-N伸缩振动，还可得知他的侧链构象，如苯丙氨酸的单机取代苯基环，色氨酸的吲哚环和酪氨酸的对羧苯基环的信息，一级后二者存在形式随其微环境而变化的信息。还可以研究构想灵敏的基团（电离的羧基、硫基、S-S键C-S键构想变化。对于残基内氢键的变化也能提供一些信息。1. 蛋白质的拉曼光谱1.1主链构象：蛋白质的主链构象的拉曼光谱复杂、多样，它们主要由肽键和骨架C-C和C-N对光散射产生的。肽键（-CONH-）产生不同类型的振动（如酰胺A、酰胺B、酰胺I、II、III、IV、VII）的谱带。其中酰胺I、III产生非常重要的谱带，这些谱带是蛋白质构想变化的灵敏探针。1.2蛋白质二级结构的定量估计：在水中，蛋白质接近天然状态，因此，在该状态测定蛋白质的二级结构，对于研究蛋白质的结构与功能的关系有重大意义。现有很多种方法测定蛋白质二级结构，线面介绍常用的Lippent法。该方法是由已知二级结构的蛋白质的拉曼光谱得到一组强度参数，然后用被测蛋白质拉曼光谱的酰胺III和酰胺1谱带强度建立联立方程，从而求解蛋白质的二级结构。1.3侧链构象：蛋白质众多侧链的拉曼光谱在一些国外的专著都有介绍，但不完整。多肽链氨基酸残基的R侧链之间，或与主链骨架及水分子之间可借助一些共价键相互作用，从而影响主链的构象。在水溶液中由于 与水分子的相互作用等原因，可行成亲水区和疏水区，这些区域往往与蛋白质的功能有一定联系，并在稳定蛋白质空间构象中发挥作用。疏水区：多肽链中具有非极性侧链的氨基酸，如Leu Ile Val等，其R侧链有避开水的趋势，当许多这类非极性侧链聚集在蛋白质分子内部时便形成疏水区。肌红蛋白分子中有一疏水空穴，血红素分子，疏水环境对保证分子中的Fe 2+与O2的可逆结合至关重要；亲水区：氨基酸的极性R侧链趋向于分布在蛋白质分子表面球蛋白的构象并增加蛋白质的水溶性。在一些蛋白质中，几个亲水氨基酸侧链形成的亲水区与蛋白质的功能有密切关系，如酶的活性中心常存在Ser His Cys等具有极性R侧链的氨基酸残基，它们直接参与酶的催化作用。三 核糖的拉曼光谱激光拉曼技术越来越经常地被用来探测蛋白质等生物大分子的分子结构, 特别是它们在低浓度水溶液中的自然构象。但大多数蛋白质在激光照射会出现荧光,以至难以获得清晰稳定的图谱。长期以来, 为了消除荧光, 主要采用大功率激光对样品进行长时间照射的方法, 使荧光强度降到可接受的水平。即使经过用激光照射消荧光的预处理, 在测试有较大荧光产率的蛋白质等生物样品拉曼光谱时,为防止荧光干扰和谱带波动,必须扫描速度很慢,积分时间很长,往往扫描一次需数小时甚至数小时以上。硝基苯萃取法则可以迅速拌灭蛋白质分子的荧光,得到稳定清晰的拉曼谱图,并可由此进行定性的构象分析,推测蛋白质的二级结构。因而它对获得高质量的蛋白质分子拉曼谱图来说,不失为一种简明有效的方法。四、拉曼光谱生物学应用拉受光谱应用于生物大分子结构与功能的研究：生物大分子的正常结构是维系生物体正常生命活动的关键。拉曼效应包含分子中原子所处的位置、电子的分布以及分子内作用力之间的互相影响，它被公认为是研究分子的结构和功能的有效方法之一特别是激光共振拉曼光谱灵敏度高、所需样品浓度低，反映结构信息量大等特点，可以针对复杂分子的不同色团选择性地共振激发，而相互间不受影响，尤其适用于生理水溶液状态，因此受广泛关注生物大分子的振动频率非常复杂，振动频率与分子中固定的分子群体的几何排布和键的配置有密切的关系，这种排布和配置也反映着分子间的相互作用，生物分子的这些特性影响着它们的拉曼谱，反之，通过生物分子的拉曼谱可以找出相应的振动频率，从而可以知道分子的结构，通过谱的变化可以了解分子结构的变化。因此拉曼光谱非常适合研究生物大分子的结构及变。拉曼光谱技术能用于从固体到稀溶液的各种形态样品,并且对样品没有破坏性。典型的蛋白质生物制药是浓溶液或低压升华干燥的粉末。很多情况下,产品在纯化、配制过程中要经液体、固态晶体和无定形状态。因此,拉曼光谱技术特别适用于基于蛋白质制药的流程监控和质量控制。拉曼差光谱技术还可应用于优化蛋白质产品的稳定性和贮存条件。应用内标强度和建立好的结构光谱相互关系,就能评定批量产品结构变化程度和种类。拉曼差光谱技术用于证明装到瘤骨疽因，子受体的乙二醇连接器不会影响受体领域的天然折叠,却能提高它的稳定性。同样的,抗体的长效稳定性可以用拉曼和红外光谱检测。傅立叶拉曼光谱用于溶菌酶和从种子衍生出的糜蛋白酶抑制剂稳定性的不同准备技术术的检测。把红外和拉曼光谱作为温度的函数可用于监控蛋白质热伸展性的发生。通过二维相关光谱分析数据,提供变性过程的信息。这些信息随后经蛋白质工程和公式过程用于改善稳定性。共聚焦拉曼成像方法能用于检测小麦谷物质地,经检测发现2螺旋二级结构数量与小麦硬度相关是小麦转为面粉过程的一个重要特征。拉曼差光谱技术在医疗诊断中的应用前景也很可观。应用拉曼差光谱分析疾病模型羊神经系统退行性病变与血清拉曼光谱变化之间存在相关性,有望建立快速诊断疾病的方法应用拉曼显微镜分析阿兹海默症患者脑内老年斑(淀粉样蛋白质)的