S179C突变提高宇佐美曲霉木聚糖酶(XynII)热稳定性的研究.doc

S179C突变提高宇佐美曲霉木聚糖酶（XynII）热稳定性的研究孙军亭通讯作者第一作者：硕士研究生，李文静2，邬敏辰2*1(江南大学生物工程学院，江苏无锡，214122)2(江南大学医药学院，江苏无锡，214122)摘要 宇佐美曲霉木聚糖酶（XynII）是G/11族高比活木聚糖酶的一种，通过S179C定点突变，发现酶最适反应温度由原来的50提高到52；50热处理，半衰期由原酶的23min延长到突变后酶的70min，热稳定性提高到原来的3倍；最适反应pH无变化。本研究提出了一种改造酶分子提高热稳定性的新思路。关键词 木聚糖；木聚糖酶；热稳定性；定点突变Enhancement of the thermostability of Aspergillus usamii family-11 xylanase by S179C-directed mutagenesisSun Junting 1, Li Wenjing2, Wu Minchen2*1(School of Biotechnology, Jiangnan University, Wuxi, 214122, China)2(School of Medicine and Pharmaceutics, Jiangnan University, Wuxi, 214122, China)Abstract Xylanase from Aspergillus usamii belongs to family-11 and it is a type of xylanase which has high relative activity. With the method of S179C-directed mutagenesis, its optimum reaction temperature was improved from 50 to 52 and after 70 min of incubation at 50 it still had 50% residual activity, while the residual activity of the native xylanase was 50% only after 23 min at the same incubation temperature. The thermostability was enhanced 3-fold. However, there was no notable changes in optimum pH.Key words xylan; xylanase; thermostability; site-directed mutagenesis木聚糖(xylan)是一类分子结构复杂的不均一多糖，是植物半纤维素的重要组分，约占植物总糖的三分之一1，在自然界中是继纤维素之后含量第2丰富的可再生生物资源2。但木聚糖在许多工业中不能被直接利用甚至是有害的，只有将其降解为低聚木糖和木糖才能加以利用，变废为宝；如饲料中的木聚糖不能被单胃动物消化，反而增加了食物的粘度，阻碍其它营养物质（脂肪和蛋白质等）的吸收，故木聚糖又被称为抗营养因子3。木聚糖酶（xylanase）是指能专一降解半纤维素中木聚糖为低聚木糖和木糖的一组酶的总称；木聚糖酶在饲料、食品、造纸、纺织和能源等工业中显示出广阔的应用前景；其中一个重要的用途是作为饲料添加剂应用于饲料工业，木聚糖酶能有效降解木聚糖，一方面使畜禽胃肠内食物粘度降低，有利于胃肠蠕动，促进畜禽的消化和吸收功能；另一方面酶水解产物低聚木糖和木糖能增加肠道内有益菌的数量，降低畜禽的腹泻率4,5。宇佐美曲霉（Aspergillus usamii）木聚糖酶属酸性木聚糖酶，具有高比活性，最适pH4.2，最适反应温度506；本实验室已从宇佐美曲霉中克隆出其木聚糖酶基因（xynII）7，并在大肠杆菌和毕赤酵母中得到表达8；国内杨浩盟等9在这方面做的比较好，他们基因改造后的木聚糖酶XynB在毕赤酵母（GS115）中表达，250mL三角瓶摇床水平上最高酶活可达42IU/mL发酵液；而我们的木聚糖酶XynII以相同载体、宿主在同样的水平上表达，原酶最高酶活可达66IU/mL发酵液。但XynII热稳定性不是很好。本研究旨在利用蛋白质高级结构与一级结构关系的理论和知识，通过分子生物学的手段找到一株热稳定性更加突出的木聚糖酶。1 材料与方法1.1 材料菌种与质粒：木聚糖酶基因xynII（GenBank收录号为：DQ114485）由本实验从宇佐美曲霉（Aspergillus usamii）中克隆出，并构建到pET-28a(+)-xynII载体上；菌株大肠杆菌（E. coli）BL21-(DE3)-Codonplus，DH5,载体pET-28a(+)；毕赤酵母GS115、载体pPIC9K均由本实验室保存。培养基：大肠杆菌培养基LB，毕赤酵母培养基YPD、MM、MD、BMGY和BMMY配方参见Invitrogen公司的毕赤酵母表达手册。工具酶和生化试剂：限制性内切酶Eco R I、Not I、Sal I、T4 DNA连接酶及DNA回收试剂盒为TaKaRa公司产品；DNA分子量标准、蛋白质分子量标准、YNB、酵母膏及蛋白胨购自上海生工生物工程有限公司，可溶性木聚糖 (From birchwood)为Sigma公司产品；其它化学试剂均为国产分析纯。1.2 定点突变拟突变掉的氨基酸是位于XynII第179位的丝氨酸，该氨基酸处于XynII的C末端，因此突变引物和下游引物为一条引物，在该引物中设计Not I酶切位点。突变引物(下游引物)：S179C.Y：5-A TTT GCG GCC GCT TAA GAA GAT ATC GTG ACA CAG GCA CTG CC-3上游引物中的酶切位点拟用质粒pPIC9K中的Eco R I，据此设计引物。 上游引物： XynII.E：5-CG GAA TTC AGT GCC GGT ATC AAC TAT G-31.3 重组表达载体的构建以pET-28a(+)-xynII为模板，PCR扩增出目的基因（图1），割胶回收，用限制性内切酶Eco R I、Not I双酶切，同时用这两个酶双酶切空的pPIC9K质粒，电泳后割胶回收，16过夜连接，热激转化大肠杆菌DH5，阳性克隆抽质粒检验（图2），选一株(3号)有抬高(证明连接质粒连上了目的基因)的菌送上海生工生物工程有限公司测序，测序结果显示构建的质粒与目标设计一致。 图2 重组菌抽质粒的电泳检验1、7为空的pPIC9K空质粒对照；2、3、4、5、6为重组质粒，其中3、5、6有明显抬高（证明质粒重组成功）图1 PCR扩增目的基因电泳1：以含xynII基因的质粒为模板扩增出的目的基因；2：以xynII基因为模板扩增出的目的基因；M：DNA 分子量标准1.4 重组XynII在毕赤酵母中表达1.4.1 酵母的电激转化与筛选将重组质粒pPIC9K-xynIIS179C用限制性内切酶Sal I线性化，电击转化毕赤酵母GS115，挑选阳性转化子，电转化及筛选方法参见Invitrogen公司操作手册。1.4.2 重组酵母的培养和诱导表达重组酵母的发酵为高密度补料发酵，发酵过程分为菌体培养和诱导表达两个阶段，据体方法参见参考文献10和Invitrogen公司的毕赤酵母表达手册。1.5 重组木聚糖酶的纯化酵母发酵上清液用NH2SO4沉淀，离心分离，以缓冲液回溶，透析袋透析，再经Sephadex G-50柱纯化，得到电泳纯的目标蛋白。1.6 木聚糖酶活性的测定酶活性测定采用DNS法：于25mL的具塞试管A、B中各加入底物2.0mL，50预热510min，在A管中加入0.5mL适当浓度的酶液，50准确反应15min，立即分别加入2.5mL DNS试剂，在B管中补加0.5mL的酶液，煮沸7min，冷却后各加水5mL，摇匀，540nm处以B管为空白对照测定A管的光吸收；从木糖标准曲线上查了相应的还原糖（以木糖计）含量，折算成酶单位。酶活单位定义：1 个木聚糖酶活单位(IU)为以0.5%可溶性木聚糖(From birchwood, Sigma)为底物，在最适条件pH4.2和50下反应1min分解木聚糖生成1mol木糖所需的酶量。1.7 酶学性质的分析与比较将纯化后的突变酶与原酶（同样经毕赤酵母表达并纯化）进行酶学性质的比较研究。包括酶的最适反应温度，最适反应pH值和热稳定性。2 结果2.1 确定突变位点对XynII的同源建模在esypred服务器上完成，其三维模型如图3；整个酶分子成右手型构象，主要由一个短的-螺旋和两组反向平行的-折叠片构成。图4 S179C突变酶经毕赤酵母表达后发酵上清液的Sephadex G50洗脱曲线图3 木聚糖酶XynII三维结构的pretty模型 其中显示侧链的氨基酸是其第179位丝氨酸定点突变为半胱氨酸研究木聚糖酶XynII的三维结构，发现其外层反平行-折叠片组成一个平面，该平面与水环境的相互作用影响到酶分子内部各功能部位间的相对运动。分析该平面上氨基酸的组成，发现该平面包括23个氨基酸，6个非极性氨基酸的侧链全部指向分子的内部，有利于稳定分子结构；17个是极性氨基酸，占73.9，全部指向分子外部，有利于酶分子与溶液中做布朗运动的水分子相互作用，对维持酶分子的完整结构和空间构象不利；将该平面封闭或改变其中的某一个或几个氨基酸，则会降低以上不利因素，达到提高该酶热稳定性的目的。分析发现XynII第179位丝氨酸处于外层反平行-折叠片组成的平面接近中心的位置，突变其为半胱氨酸，在毕赤酵母中表达时可能形成分子间二硫键，屏蔽该平面，降低酶分子与溶液中其它物质相互作用的比表面积，达到提高该酶热稳定性的目的。2.2 定点突变以xynII为模板，通过PCR扩增完成S179C突变，双酶切后将突变基因连接到穿梭质粒pPIC9K上；通过测序分析，确定突变位点与目标设计的突变位点一致。2.3 重组木聚糖酶在毕赤酵母中表达用含遗传霉素的YPD平板筛选高考贝毕赤酵母，三角瓶发酵采用本实验室周晨妍师姐先前所做的最优化培养条件，即250mL三角瓶装培养基50mL，BMGY种子培养基培养24h，BMMY发酵培养基诱导表达108h，发酵上清液测酶活性，酶活力最高一株重组毕赤酵母的木聚糖酶活性为53.2IU/mL发酵液。2.4 木聚糖酶XynIIS179C的纯化发酵液经12000rpm离心10min以除去固形物，所得上清液直接用Pharmacia公司Sephadex G-50柱层析，层析曲线如图4。经纯化后达到电泳纯的突变酶XynIIS179C（图5），与经同样操作得到的毕赤酵母表达的原酶XynII一起进行酶学性质的比较。图6 原酶与突变后酶的最适反应pH比较图5 纯化后木聚糖酶的SDS-PAGE电泳M：蛋白质分子量标准 1：纯化后的原酶（XynII） 2：纯化后的突变酶（XynIIS179C）图7 原酶与突变后酶最适反应温度的比较图8 原酶与突变后酶50时热稳定性的比较2.5 酶学性质的比较实验结果表明，XynIIS179C的最适反应pH值没有变化，仍为4.2（图6）；最适反应温度由原来的50上升了2，达到52(图7)；采用50热处理，半衰期由原酶的23min延长到突变后酶的70min，热稳定性提高到原来的3倍（图8）。3 讨论运用生物信息学的手段，在esypred服务器上对XynII进行同源建模，建模结果用开源蛋白质结构分析软件PyMOL11进行分析；分析结果显示XynII具有G/11族木聚糖酶的分类特性和三级结构12。原酶（XynII）与突变酶（XynIIS179C）的Sephadex G-50层析曲线相同（出酶活峰的时间、形状和面积相同）（图4），两个酶的洗脱条件相同，且条件温和（用pH4.2的磷酸氢二钠-柠檬酸洗脱），不会破坏二硫键；这说明突变酶和原酶大小相同，结构相似；由此得出突变酶并没有如设计的那样形成分子间二硫键的结论。这一结果与Miyazaki K等人13的报道不相一致，这可能与两方面的因素的有关：一是XynII与Miyazaki K等人报道的蛋白存在较大的序列差异性，XynIIS179C分子外层-折叠片平面上的其它氨基酸侧链阻碍两了个Cys的靠近，二是毕赤酵母GS115菌株和KM71菌株存在表达和修饰差异。丝氨酸与半胱氨酸在分子的空间结构上相似，但它们侧链的化学性质不同，丝氨酸的侧链末端为羟基，半胱氨酸的侧链末端为巯基，丝氨酸的侧链羟基在水环境中不解离，半胱氨酸的侧链巯基解离常数为8.3314，这降低了XynIIS179C分子表面与水环境的相互作用，可能正是这个原因使XynIIS179C的最适反应温度和对热稳定性都得到了一定的提高。影响木聚糖酶热稳定性的因素很多，如Arg和Pro的含量，蛋白结构中盐桥的形成，二硫键的引入，芳香族氨基酸间的相互作用等15，这些都是从单个酶分子内部的相互作用来研究的，有大量的实验证据，可作为分子改造木聚糖酶的依据。从酶分子与容液微环境的相互作用角度来研究酶的热稳定更符合实际环境下的酶反应条件，有坚实在理论依据；但从该角度设计突变酶的分子改造方案尚属首次，该设计思路也可应用于分子改造其它酶提高对热稳定性的研究上。参考文献1 Collins T, Gerday C, Feller G. 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