蜜环菌营养条件优化.docx

蜜环菌营养条件优化作者：李亚宁（天水师范学院生命科学与化学学院，甘肃 天水，741001）【摘 要】以蜜环菌为研究对象，在蜜环菌栽培过程中添加一定量的不同辅助营养源以考察辅助营养物质对蜜环菌生长的影响，为实现蜜环菌的大规模生产奠定基础。用蜜环菌作栽培种，锯末和麸皮作主要营养源，不同量的蛋白胨、琼脂、黑曲霉ZM-8液、苹果枝节、苹果枝片、三十烷醇8ppm、萘乙酸10ppm、青冈木、卫生纸2g作辅助营养源培养蜜环菌。比较了添加有9种辅助营养源的培养基对蜜环菌菌索生长速度的影响。与对照相比，加入辅助营养源后，菌索生长速度提高，菌种生长状况得到改良，表现为菌索长势旺、分枝多、粗壮、色白等。其中，菌索在加有50g苹果枝节的培养皿中生长速度最快，长势最强，平均生长速度达到了2.1 mm/d，比对照组中菌索的生长速度快0.58 mm/d。所添加的9种辅助营养培养基中，最适合菌索生长的是加有苹果枝节的菌枝培养基。苹果树是天水地区的普遍植物，其枝条产量丰富，可以作为蜜环菌栽培种的辅助营养源加以利用。【关键词】蜜环菌 培养 辅助营养源 优化Optimization of Armillaria Nutritional ConditionsAuthor: Li Ya-ning Tutor: Zhang Zong-zhou(College of life-science and chemistry, Tianshui Normal University; Tianshui, Gansu province; 741001)Abstract: Added a certain amount of different auxiliary source of secondary nutrition in the Armillaria mellea cultivation process in order to study the effects of nutrients to the growth of Armillaria, laying the foundation to achieve large-scale production of Armillaria mellea. Armillaria mellea for cultivated species, sawdust and bran as a primary source of nutrition, different amounts of peptone, agar, the black Aspergillus ZM-8 solution, Apple minor, apple branch piece, Triacontanol 8ppm,Naphthylacetate 10ppm,cyclobalanopsis wood,toilet paper 2g as secondary nutrient source of Armillaria. Compared the impact to the growth speed of Armillaria mella with medium had added 9 kinds of supplementary nutrition. Compared with the control group, after adding the supplementary nutrient sources, the growth speed is improved cable bacteria, bacterial growth conditions have been improved, performance for the rhizomorph growth vigor, much-branched, stout and color white. Among them, rhizomorph with the fastest growth and vigor in culture dish 50g apple branch. In addition, the average growth rate reached 2.1 mm/d,the specific growth rate of the control group was 0.58 mm/d cable. The addition of 9 kinds of nutrient medium, the most suitable rhizomorph growth is with apple branches side bacteria culture medium. The apple tree is a common plant in Tianshui region, its branches abundant, can be used as supplementary nutrient source of Armillaria mellea cultivated utilization.Keywords: Armillaria mellea; culture; auxiliary source of nutrition; optimization1 引言蜜环菌Armillaria mellea(Vah：fr)Que.l隶属于担子菌纲(Basidiomyce tae)、伞菌目（Hymenomycetes）、口蘑科（Tricholomataceae）、蜜环菌属Ar millaria(Fr:Fr)staude1, 别名榛蘑、蜜蘑、蜜环谭、苞谷谭、青冈谭。子实体一般中等大，菌盖直径4-14cm，菌肉白色，菌柄细长、圆柱形，菌环白色，生柄的上部。蜜环菌广泛分布于亚洲、欧洲、北美洲等温带地区,中国的河北、山西、黑龙江、浙江、广西、甘肃等地也有分布，常见于硬木森林和针叶林中2-3。密环菌菌丝体中含有40多种化合物，其中有多元醇、酚、有机酸、脂类化合物、嘌呤、衍生物、原伊鲁烷型倍半萜芳香酸脂等8-10，18-20，是一种营养价值很高的食用菌4，具有良好的药用价值，也是中药天麻、猪苓不可缺少的互惠共生菌 7。天麻和猪苓的栽培离不开蜜环菌的营养供给。蜜环菌可用于治疗头痛、眩晕、失眠、惊风、肢麻及腰、膝酸痛，还可以治疗高血脂症，保护和降低血脂等生理活性,也用于预防视力失常、眼炎、夜盲、皮肤干燥、呼吸道和消化道感染等疾病。现已制成蜜环菌片、蜜环菌冲剂、蜜环菌糖浆、复方天麻蜜环菌片等多种药剂。目前，蜜环菌菌丝体的培养有液体深层发酵和固体发酵两种方法15，蜜环菌因配方成分比例的不同而生长旺盛程度不同，菌索也有明显差异13。蜜环菌不同于一般的食用菌，在其生活史的大部分阶段都是以菌索的形式存在。菌索是由许多营养菌丝编织在一起形成像绳索一样的组织。菌索可以保护其免受外界不良环境因素的侵害，并合理分配内部资源，适应新环境，提高成活率。菌索可以形成巨大的网络，吸收和传送营养物质16。生产上蜜环菌栽培菌株较多，栽培配方及栽培特性也存在差异。以往的研究主要对培养基成分比例的研究有重要突破，而在培养基成分研究上存在很多不足。为提高蜜环菌的生产效益，本研究在前人研究基础上通过用优良的蜜环菌栽培种，对蜜环菌原种最适栽培配方进行研究，对培养基基本配方加以辅助营养源，考察分析了蜜环菌菌索生长速度和长势，确定了影响密环菌菌索生长发育的主要因素，筛选出最佳配方，优化密环菌培养基的组分，缩短培养时间，最终提高蜜环菌产量和品质，降低生产成本，促进蜜环菌生产进而促进天麻生产。2 材料与方法2.1 试验材料2.1.1 供试菌种供试菌种为蜜环菌，由昭通神农乌天麻良种繁育有限公司提供。2.1.2 主要实验试剂（1）药品：锯末，麸皮，玉米面，大豆面，白糖，石膏粉，KH2PO4，多菌灵，蛋白胨，琼脂 ，青钢木。（2）试剂：黑曲霉ZM-8液（制备方法：挑取5g黑曲霉ZM-8置于三角瓶中，加100ml水，浸泡5h），三十烷醇8ppm， 萘乙酸10ppm，卫生纸，自来水。2.1.3 主要仪器设备高温灭菌锅，无菌操作室，恒温培养箱，培养皿，烧杯，量筒。2.1.4 菌枝及其处理供试菌枝为苹果枝条， 采自天水南山。用3%的石灰水溶液浸泡枝条30min进行杀菌，杀菌后取出凉置10min至表面水干。(1)苹果枝节取直径为0.5-1.0cm的苹果枝条，用剪刀将其切成0.2cm长的小段，置于500ml烧杯中，用凉水浸泡后备用。(2)苹果枝片取直径为0.5-1.0cm的苹果枝条，用小刀将浸泡好苹果枝条切成小木片，置于500ml的烧杯中，用凉水浸泡后备用。2.2 实验方法给以密环菌基本配方各附加一些辅助营养源，设计9个实验组、3个对照组，通过观察比较不同培养基成分对密环菌生长的影响，主要通过对密环菌菌索生长的观察和分析，用SPSS17.0软件分析菌索的生长速度，从而得出对密环菌生长有影响的因素，配制出对密环菌生长更加有利的培养基。2.2.1 培养基的制备（1）培养基基本配方：按锯末75%，麸皮15%，玉米面5%，大豆面2%，白糖1%，石膏粉1%，KH2PO41%，多菌灵0.1%的配比称取干料100g。（2）辅助营养源及其浓度：按蛋白胨0.25%、琼脂 0.2%、黑曲霉ZM-8液（挑取5g黑曲霉ZM-8置于三角瓶中，加100ml水，浸泡5h）100ml、苹果枝节100g、苹果枝片97%、三十烷醇8ppm（5ml）、 萘乙酸10ppm（5ml）、青冈木80%、卫生纸3g 的比例或质量分别将10种辅助营养源加入基本配方中，各加水180ml，混匀后制备培养基。培养基原料配比如下：表1 蜜环菌营养配方Table1 Armillaria mellea nutritional formula*注：（大）、（大）分别指号、号大培养皿，其他的均为小培养皿。按表1配比用电子天平分别称取干料100g，置于12个小塑料盆中，用200ml烧杯量取自来水150ml，分别加入12个小塑料盆中，混匀，然后将每只盆中原料分别装入5只已洗净的培养皿中，每皿含干料20g，其中配方(大)和(大)中原料分别装入2只大培养皿中，每培养皿含干料50g。2.2.2 灭菌用双层报纸将培养皿每5只包裹在一起，其中大培养皿4只包裹在一起，高温灭菌20min。2.2.3 接种灭菌后，凉10min至培养基温度降至室温后接种，在无菌操作室接种。在无菌条件下用接种钩将斜面菌种打碎，然后转移到培养皿中。2.2.4 菌种培养及观察将恒温培养箱的温度调至25，恒温培养5d，每天观察并记录菌丝萌发情况2次，待各培养基中菌丝全部萌发后，移至实验桌上培养，保持室内温度18-25，通风透气，避免阳光直射。每3d观察一次，并记录密环菌菌索生长状况。2.2.4.1 生长速度测定用厘米尺在培养皿表面测定蜜环菌菌索长度，并记录数据，单位为cm，测量值精确到mm。2.2.4.2 其他性状观察观察记录蜜环菌的色泽、粗细度、疏密性等。粗细度用“+”表示，“+”表示细，“+”表示较粗，“+”表示粗壮；疏密性用“x”表示，“x”表示稀疏，“xx”表示较密，“xxx”表示密集。3 结果与分析3.1 实验原始数据记录从蜜环菌菌索的长度变化，粗细度、疏密性、色泽的不同，菌索的初生时间和满皿时间几方面进行了观察记录，见表2、表3。表2 蜜环菌菌丝生长观察记录Table2 Records of the growth status of Armillaria mellea 实验编号菌索（丝）长度/cm粗细度疏密性色泽581114172023(d)0.20.72.12.52.93.64.4+xxx黄棕色0.20.61.32.02.32.73.2+xx黄棕色0.10.61.21.722.22.3+xx棕色0.51.22.12.32.72.93.7+xx黄白色0.311.51.82.33.23.8+xx黄白色（大）0.51.11.72.53.13.74.4+xxx黄白色-0.20.60.91.31.51.5+x褐色（大）-0.40.81.11.722.1+x棕色0.10.51.61.92.12.32.4+x黄棕色0.311.51.61.81.92+xx褐色0.20.81.61.61.81.81.9+x褐色-0.41.61.61.92.12.1+xx褐色表 3 蜜环菌生长周期记录Table 3 The growth cycle records of Armillaria 实验编号菌丝萌发时间/d菌索初生时间/d菌索满皿时间/d2-35-623-243-46-726-272-35-728-2936-725-262-35-623-24 （大）25213-47-831-34 （大）2-38-929-322-37-8264-5928-3136-734-3847-931-353.2 实验数据分析3.2.1 生长速度比较实验表明，不同辅助营养源的培养基对蜜环菌菌索（菌丝）生长速度影响不同（表4、图1）。在添加有苹果枝片、萘乙酸10ppm、青冈木、卫生纸的4个实验组中， 菌索生长速度基本一致， 各配方下菌索的生长速度无显著差异(P0.05)。而在添加了黑曲霉ZM-8液的营养条件下， 菌索平均生长速度随锯末和麸皮量的增加而加快， 其中， 加有78%锯末和20%麸皮的培养皿中菌索生长速度比加有75%锯末和15%麸皮中菌索生长速度快0.66 mm/d。供试菌在加有三十烷醇8ppm培养基的菌索速度为1.14mm/d，低于对照组，在添加有蛋白胨的培养皿中， 菌索生长速度较快，菌索生长速度比加有琼脂的培养皿(对照组)中菌索生长速度快0.58mm/d。而在添加有苹果枝节的培养皿中，菌索长势明显升高，并且随枝节量的增加而长势增强。其中，在加有50g苹果枝节的菌皿中菌索生长速度最快，平均速度为2.10mm/d， 比对照组号培养皿中的菌索生长速度快0.58mm/d。比较供试菌在添加了9种辅助营养源后的菌索的生长速度，苹果枝节和蛋白胨最有利于蜜环菌菌索的生长， 菌索平均生长速度均达2.0mm/d以上， 其中加有50g苹果枝节的培养皿菌索生长速度是对照的1.38倍， 与其他条件下菌索生长速度均存在显著性差异(P0.05)。表4 不同配方蜜环菌的菌索（丝）生长速度及生长势比较Table4 Different formulations of Armillaria bacteria cable (silk) growth rate and growth potential of comparison配方菌索生长速率(mm/d)生长势位次差异显著性1234567平均值0.050.67 1.67 4.67 1.33 1.33 2.33 2.67 2.10 4a0.67 1.33 2.33 2.33 1.00 1.33 1.67 1.52 3b0.33 1.67 2.00 1.67 1.00 0.67 0.33 1.10 3c1.67 2.33 3.00 0.67 1.33 0.67 2.67 1.76 3ab1.00 2.33 1.67 1.00 1.67 3.00 2.00 1.81 3ab（大）1.67 2.00 2.00 2.67 2.00 2.00 2.33 2.10 4a0.00 0.00 1.33 1.00 1.33 0.67 0.00 0.62 1d（大）0.00 0.00 1.33 1.00 2.00 1.00 0.33 0.81 1c0.33 1.33 3.67 1.00 0.67 0.67 0.33 1.14 3b1.00 2.33 1.67 0.33 0.67 0.33 0.33 0.95 2c0.67 2.00 2.67 0.00 0.67 0.00 0.33 0.90 1c0.00 0.00 4.00 0.00 1.00 0.67 0.00 0.81 2c图1 不同配方蜜环菌的平均生长速率比较Feg.1 Compared to the average growth rate of Armillaria Mellea in different formulations3.2.2 生长势比较试验表明，不同配方培养基对蜜环菌的菌索生长势影响不同（表4）。从表4可以看出，在不同辅助营养源配方中，配方和（大）菌索生长势较强；其次为配方、；配方和生长势最弱。3.2.3 其他培养性状比较于供试蜜环菌栽培过程中添加不同辅助营养源后，蜜环菌菌丝萌发时间、 菌索初生时间、 菌索满皿时间都有不同（见表3），菌索颜色、分枝状况及粗细等特性都有所差异（见表2）。表2和表3显示，在加有苹果枝片、萘乙酸10ppm、青冈木、卫生纸4种辅助营养源的培养皿中，菌丝萌发、菌索初生和长满培养皿的时间基本一致，菌索的分枝少，较细，颜色为褐色。在加有三十烷醇8ppm的培养基菌索开始生长时间和满皿时间缩短，菌索粗壮且色黄。在加有黑曲霉ZM-8液营养液的菌索开始生长时间和长满培养皿时间随锯末和麸皮干料量的增加而缩短， 其中，添有78%锯末和20%麸皮的培养皿中菌索满皿时间比添有75%锯末和15%麸皮中的菌索满皿时间提前3天，颜色也变浅，表现为黄白，菌索均分枝较多。菌索在添加有蛋白胨培养皿中不仅满皿时间提前，而且菌索粗壮，但颜色黄棕。在添加有不同量的苹果枝节配方中，菌索在加有50g的大培养皿中长势最强，21天后菌索长满皿盖，色白、粗壮且有大量分枝。综合比较结果表明，在加有9种辅助营养成分菌皿中，蜜环菌菌丝萌发时间和菌索初生时间相差不大，但均比对照中菌索开始生长时间早，只有配方中的菌索萌发较迟。添加有黑曲霉ZM-8液的配方和三十烷醇的配方中，蜜环菌菌索长满培养皿所需时间较短。蜜环菌在添加有蛋白胨和苹果枝节的菌皿中，菌索满皿时间明显缩短，为不到25d,比对照组中菌索满瓶底的时间提前3-6d，并且分枝大量，生长粗状，颜色黄白，对照组中的菌索则分枝少、细、 颜色变深，出现退化。4 结论在生产上，蜜环菌是天麻和猪苓赖以生存的支柱，蜜环菌的生长状况直接影响天麻和猪苓的接菌状况及产量。凡是使菌索生长旺，分枝多，长势强且色白的培养基就是适合蜜环菌培养的优质培养基17。结果显示，不同培养条件下的蜜环菌的生长速度相对于对照组出现了明显的差异，在加有50g苹果枝节作为辅助营养成分，菌丝萌发时间和菌索初生时间满皿时间均最短，生长速率最快，可在较短时期内布满整个培养皿，且菌索粗壮，分支大量，颜色黄白，明显快于其他配方，差异均达到显著水平。说明了在添加的9种辅助营养配方中，最适合菌索生长的是加有苹果枝节的培养基。蜜环菌栽培过程中，添加有不同的辅助营养因子对蜜环菌生长具有一定影响，其中以加有苹果枝节效果最好，其次为加有蛋白胨的。苹果枝的成分较为复杂，除可为蜜环菌的生长补充必要的碳源和氮源外，还可为其生长提供微量元素等其他营养成分。由于苹果树是天水地区的普遍植物，分布广泛，其枝条产量丰富，取材方便，成本低廉。因此，可替代蛋白胨作为蜜环菌配方的辅助营养，在蜜环菌栽培过程中作为辅助营养源加以利用，从而提高经济效益。5 讨论蜜环菌菌索在加有苹果枝片的培养皿中的生长速度明显劣于加有苹果枝节培养皿中的，可能是由于配方中没有锯末、麸皮和大豆面，苹果枝片不能被作为主营养源加以利用，或是与鲜嫩苹果枝节比枝片的易侵性有关。在加有黑曲霉ZM-8营养液的培养基中，发现加入黑曲霉ZM-8后，蜜环菌长势比号对照组略优，但差异不显著，并且随着锯末和麸皮配比的增大长势增强，至于黑曲霉ZM-8是否具有糖原之功效，有待进一步研究确定。参考文献：1 邵力平,沈瑞祥,张素轩等.真菌分类学M.北京:中国林业出版社,1984:1-262.2 吴兴亮,连宾,邹方伦.贵州蜜环菌资源及其生态研究J.贵州科学,2003,21(3):56-60.3 秦国夫,赵俊,郭文辉等.蜜环菌的生物学研究进展J.东北林业大学学报,2004,32(6): 89-94.4 徐锦堂.中国药用真菌学M.北京:北京医科大学,中国协合医科大学联合出版社,1997: 74-582.5 郭顺星,徐锦堂.蜜环菌索发育的研究J.真菌学报,1992,11(4):308-313.6 蔡义荣.浅谈天麻和蜜环菌及其共生关系J.生物学通报,1987,22(1):11-12.7 杨峻山,苏亚伦,于德全等.原伊鲁烷型倍半萜醇芳香酸酯的碳谱研究J.波谱学杂志, 1992