低温生物学课程综述.docx

低温生物学课程综述低温生物学是研究低温（包括深低温）对生物的影响及其应用的生物学分支学科。通常所谓低温是指0左右，深低温一般指 -80以下。总所周知，离体细胞、组织和器官在常温环境下不能长期保存，为了长期保持这些离体的生命材料的生物功能，必须采用低温保存的方式对这些材料加以处理。低温生物学是近几十年随着生物学、医学和低温制冷技术的发展而逐渐形成的一门边缘学科，是研究在自然和人工低温条件下生命体、组织、细胞不同层次的活动规律及其应用的学科。具体而言，低温医学是研究低温对人体的影响、冷冻损伤的防治以及利用低温技术实现或达到医疗目的的一门学科。本文简要讨论细胞低温损伤机制以及低温保存的原理和应用。1、细胞的低温保存目前，低温保存是最常见的长期保存方法。细胞在低温下可以长期保存的机制在于低温 下细胞的新陈代谢急速减慢，保存温度越低，新陈代谢越慢，保存时间也就越长。在低温冰箱（-80）中细胞可以保存半年，而在液氮（-196）中，细胞则可以保存更久，可以达到两到三年。低温保存的主要优点是：便于库存大量的细胞和组织，以为科学研究提供更长的研究时间；便于各研究单位之间实验材料的调配和研究机构之间的合作；在进行组织或器官移植之前，能够有足够的时间检测和消灭其中的病菌。但是在实验中发现，低温保存过程中，本身也会对细胞和组织造成损害，低温保存是有条件的，细胞是生物体结构上、功能上、发生上的基本单位，所以低温损伤或低温保存都是以细胞变化为基础的。 低温保存的目的是将损伤减到最小，使保存后的细胞结构、遗传性能和功能不改变。细胞及组织的这些损伤源于上面保存过程中的一个步骤或 者它们的综合作用。低温生物学的一个极其重要的研究内容就是揭示与细胞及组织低温损伤相关的物理学和生物学规律，尤其是那些与细胞内外水结冰相关的损伤。理解这些原理有助于建立生物物理-数学模型，以描述低温保存过程中细胞对环境变化的反应，从而为长期低温保存细胞和防止低温损伤研制最佳的降温程序及设备。冷冻损伤主要发生在降温过程中冰晶形成的增长，相变时冰晶形成的影响以及解冻过程中冰晶的再行成。观察胚胎细胞的冻存过程发现，0-30是发生冷冻损伤的关键温区，溶液自发结晶的相变点与多种因素相关，其中冻存液的相变点与降温速率有关，降温速度越快，相变开始越早。以1/min降温时，胚胎细胞已经充分皱缩脱水，其损伤机制是“溶液效应”。2、降温过程中细胞的损伤在降温过程中，当温度降至-5左右时，细胞及其周围递质还未冻结，都处于过冷状态，在-5-15之间， 细胞外溶液开始结冰（自然结冰或人工种晶结冰），如果假定细胞膜阻止了冰晶生长进入细胞，则细胞内没有结冰，仍处于过冷状态。此时细胞内部水的化学势增大，水开始渗出细胞，然后在细胞外结冰，随后细胞的反应则取决于降温速率。如果冷却过快，细胞就没有充足的时间通过渗出水来维持内外溶液的渗透压平衡，使细胞内溶液过冷，最终细胞内开始结冰（简称胞内冰，IIF），而使细胞内外达到渗透压平衡。Muldrew等提出了胞内冷冻损伤的渗透撕裂假定和模型，认为降温过程中水穿过细胞膜后引发了细胞内结冰。Diller等研制了新型的显微技术，用以观察降温过程中细胞行为，以及胞内结冰温度和动力过程。低温保护剂对水的传输、成核结晶以及冰晶生长都有影响，因而降温过程中细胞的反 应会因添加低温保护剂而有所变化。如果降温速率很慢，细胞就有充分的时间脱水细胞内部溶液浓度就逐渐升高，过冷度开始消失，胞内冰就不容易产生。然而如果降温过慢，在达到共晶温度（所有成分均结晶）之前，细胞就会因长期处在高浓度溶液（主要为电解质）环境之下过度收缩而造成细胞损伤。Lovelock推断，溶液浓度增加及细胞脱水对细胞膜的类脂蛋白化合物有不良影响，即其功能减弱以及类脂和磷脂额流失增加，使电解质能够通过细胞膜而进入细胞，直至细胞膨胀破裂。细胞质丢失水分会使蛋白恰好进入某一位置，使得原本因距离太远、氢键结构太牢固而不能形成的一些化学键有形成的机会。但复温过程会破坏这些新化学键，使之开解和变性。呈晶格排列的束缚水对于细胞完整性来讲是必不可少的，但慢速降温使束缚水在降温过程中因参与结冰而离开蛋白质，造成细胞损伤。总的来讲，降温过快或过慢，都会对细胞造成损伤，Mazur对细胞的这一类低温算上总结出两点假定，至今仍然是低温生物学的基础：1）在降温速率较慢时，低温损伤源于“溶液效应”（即高溶液/溶质浓度下，细胞严重脱水）；2）快速降温时，低温损伤源于致命的胞内冰。对于特定细胞，必然存在一个具有最高细胞回收率的最佳降温速率。该降温速率慢得足以防止胞内冰，同时也快得足以使“溶液效应”最小，即细胞成活率与降温速率之间呈倒“U”形曲线关系。3、贮存时间和复温损伤低温保存样品的贮存温度是-70或-70以下。经历了零下降温过程的细胞在复温过程中同样要面临危险。与降温过程一样，复温过程对细胞的复苏也会构成威胁，其结果取决于前面降温过程是否诱发产生了胞内冰或者细胞脱水。如果有胞内冰产生，快速复温能防止冰晶长大（即反玻璃化），可以减少细胞损失。即便慢速降温过程中无胞内冰形成，细胞对复温速率的影响也取决于冷冻条件和细胞类型。4、低温保存的应用4.1 医用生物材料的保存医用生物材料的冻存研究，取得了很大进展，为临床移植提供了高质量的供体材料。 冷冻保存骨髓细胞的改进，采用小容量冻存， 其有核细胞回收率、造血干细胞培养 （GM - CFU - c）结果均优于大容积保存。 冷冻速率对清除T淋巴细胞人体骨髓造血功能的影响， 揭示以 0.5 / min 的冷冻速率为佳，其对骨髓造血功能影响最小，二甲基亚砜 （DMSO）对低温保存人骨髓细胞过氧化物酶 （POX）、X-萘酚酯酶（ANNAE）、糖原活性的影响，揭示以 5% l0% DMSO 影响最小。单抗清除瘤细胞后人骨髓的冷冻保存研究显示，瘤细胞清除率可达 99.3% l00%，冻存后造血细胞回收率可达 60% 左右。冻存胎肝输注治疗再生障碍性贫血与新鲜胎肝相似，效果良好。在其他医用材料保存中， 如垂体细胞、大脑细胞、肾上腺、精子、角膜、脾淋巴细胞、活性瓣膜、血管、骨骼等的研究取得了很大进展，大部分已用于临床。4.2 动植物种质低温保存在细胞和分子水平研究了猪精子的冷冻效果，建立了昆明小鼠卵及兔胚胎冻存技术和小鼠胚胎库。在种质资源低温保存方面，我国建立了两座现代化的国家种质库，实行计算机管理系统，已贮存20 余万份种质资源，仅次于美国。研究作物种质资源低温保存技术，在探索贮存种子的遗传完整性取得了重要成果，寻找出三叶草种子贮存温度，时间与发芽率间的最佳条件进行了实验， 以-l8贮存，发芽率与贮存时间呈反比。 我国建立了植物种子花粉和营养器官、牧草花粉粒、桃、梨等果树花粉；水稻愈伤组织等在-196的低温保存技术， 并在实际上取得了良好的效果。 另外一些学者还进行了甘薯、马铃薯试管苗种质保存及遗传性的研究以及大葱、大白菜种子贮存效应研究。目前， 虽然与医学应用有关的低温医学取得了很大进展，仍限于细胞、组织方面， 脏器保存仍未获得实质性突破，现各国争相攻关以期最终解决整个机体的保存，但有待于生物学、医学、物理化学、低温工程学等专家的合作，研究各类细胞的低温耐受性和生物材料的传热规律， 以期寻找减轻细胞损伤的技术，提高低温保存效果。参考文献1 Muldrew K，McGann LE. The osmotic rupture hypothesis of intracellular freezing injuryJ. Biophys,1994,66:532.2 Diller KR, Cravalho EG. A Cryomicroscope for the study of freezing and thawing process in biological systemsJ. Cryobiology,1970,7:191.3Mazur P, Leibo SP, Chu EHY. A two-factor hypothesis of freezing injuryJ.Exp Cell Res,1972,71:345.4邵