生物化学-02 蛋白质2 氨基酸化学反应.pdf

LOGO 生物化学生物化学 生物医药系生物医药系 蒋丹蒋丹 北京联合大学生物化学工程学院北京联合大学生物化学工程学院 1 与与水合茚三酮的水合茚三酮的反应反应 2 与与甲醛甲醛的反应的反应 3 与与2 4 二硝基氟苯二硝基氟苯的反应的反应 4 与与异硫氰酸苯酯异硫氰酸苯酯反应反应 5 与亚硝酸的反应与亚硝酸的反应 6 与荧光胺的反应与荧光胺的反应 氨基酸的化学反应氨基酸的化学反应 1 与茚三酮反应 与茚三酮反应 显色反应显色反应 例外 例外 Pro黄色 黄色 440nm Asn棕色棕色 aa定性定性 定量定量 氨基酸与茚三酮反应非常灵敏 几微克氨基酸氨基酸与茚三酮反应非常灵敏 几微克氨基酸 就能显色 生成的就能显色 生成的蓝紫色化合物蓝紫色化合物在在570nm有最有最 大吸收 大吸收 茚三酮反应的应用茚三酮反应的应用 定量定量 A570nm与氨基酸含量在一定范围内成正比与氨基酸含量在一定范围内成正比 定性定性 层析或电泳时显色 层析或电泳时显色 注 多肽和蛋白质也能发生此反应 但灵敏度较差 注 多肽和蛋白质也能发生此反应 但灵敏度较差 1 与 与水合茚三酮水合茚三酮反应反应 显色反应显色反应 2 与与甲醛甲醛的反应的反应 氨基酸氨基酸水溶液因氨基与羧基形成内盐 因此不能用酸碱水溶液因氨基与羧基形成内盐 因此不能用酸碱 滴定方法滴定方法测定氨基酸含量测定氨基酸含量 但若加入甲醛溶液则氨基酸 但若加入甲醛溶液则氨基酸 中的氨基作为亲核试剂与中的氨基作为亲核试剂与甲醛甲醛中的羰基发生加成反应 中的羰基发生加成反应 促使氨基酸分子上的 促使氨基酸分子上的 NH3 解离释放出解离释放出H 生成 生成N N 二羟甲基氨基酸 使溶液酸性增加 就可 二羟甲基氨基酸 使溶液酸性增加 就可以酚酞作指以酚酞作指 示剂用示剂用NaOH来滴定来滴定 滴定终点由滴定终点由12左右降到左右降到9左右 可以用左右 可以用酚酞酚酞为指示剂 为指示剂 用标准氢氧化钠滴定 用标准氢氧化钠滴定 酚酞是一种弱有机酸酚酞是一种弱有机酸 在 在pH 8 2的溶液的溶液 里为无色的内酯式结里为无色的内酯式结 构 当构 当pH 8 2时为时为 红色的醌式结构红色的醌式结构 2 与与甲醛甲醛的反应的反应 氨基酸甲醛滴定的应用氨基酸甲醛滴定的应用 测定游离氨基的含量 判断蛋白质水解或合成进度测定游离氨基的含量 判断蛋白质水解或合成进度 如如样品为一种已知的氨基酸 从甲醛滴定的结果样品为一种已知的氨基酸 从甲醛滴定的结果 可算出可算出氨基氮的含量氨基氮的含量 如样品是多种氨基酸的混合物 如蛋白水解液 如样品是多种氨基酸的混合物 如蛋白水解液 则滴定结果不能作为氨基酸的定量依据 但此法则滴定结果不能作为氨基酸的定量依据 但此法 简便快速 常用来简便快速 常用来测定蛋白质的水解程度测定蛋白质的水解程度 随水 随水 解程度的增加滴定值也增加 滴定值不再增加时 解程度的增加滴定值也增加 滴定值不再增加时 表示水解作用已完全表示水解作用已完全 2 与与甲醛甲醛的反应的反应 3 与与2 4 二硝基氟苯 二硝基氟苯 DNFB 的反应的反应 NO2 FO2N H2N CH COOH R NO2 O2NHN CH COOH R HF 弱碱性弱碱性 DNP 氨基酸氨基酸 黄色黄色 DNFB Sanger 法测定法测定N N末端氨基酸基础末端氨基酸基础 多肽多肽N 端氨基酸的端氨基酸的 氨基也能与氨基也能与DNFB反应 生成反应 生成DNP 多肽 经酸水解时 肽键被切开 只有多肽 经酸水解时 肽键被切开 只有DNP基仍连在基仍连在N 端氨基酸上 形成黄色的端氨基酸上 形成黄色的DNP 氨基酸 用乙醚把氨基酸 用乙醚把DNP 氨基酸抽提出来 再进行纸层析分析 可氨基酸抽提出来 再进行纸层析分析 可鉴定鉴定N端氨基端氨基 酸酸的种类和数目 这一方法被的种类和数目 这一方法被Sanger用来鉴定多肽或蛋用来鉴定多肽或蛋 白质的末端氨基酸 故称白质的末端氨基酸 故称Sanger法法 3 与与2 4 二硝基氟苯 二硝基氟苯 DNFB 的反应的反应 多肽或蛋白质多肽或蛋白质 的的N 端氨基酸端氨基酸 DNFB DNP多肽多肽 DNP氨基酸氨基酸 酸水解 弱碱性 乙醚抽提乙醚抽提纸层析鉴定纸层析鉴定 替代试剂 替代试剂 5 二甲氨基萘磺酰氯 二甲氨基萘磺酰氯 DNS Cl 又 又 称称丹磺酰氯丹磺酰氯 3 与与2 4 二硝基氟苯 二硝基氟苯 DNFB 的反应的反应 N S H3CCH3 Cl OO H2NCHCOOH R pH9 7 40 N S H3C HN OO CH3 CHCOOH R DNS ClDNS 氨基酸氨基酸 强荧光强荧光剂 用于多肽剂 用于多肽 链末端 链末端 a的标记和的标记和 微量 微量 a的定量测量的定量测量 灵敏度高 灵敏度高 4 与与异硫氰酸苯酯异硫氰酸苯酯的反应的反应 N C S N CH COOH H HR PITC N C N CH COOH HHR S PTC 氨基酸氨基酸 N C HR S NC C OPTH 氨基酸氨基酸 pH8 3 无水HF 苯氨基硫甲酰衍生物苯氨基硫甲酰衍生物 苯乙内硫脲衍生物苯乙内硫脲衍生物 Edman降解法基础降解法基础 又名 又名 苯异硫氰酸酯 苯异硫氰酸酯 PITC Edman 降解降解 Edman degradation 从多肽链从多肽链 游离的游离的N末端测定氨基酸残基的序列的过程 末端测定氨基酸残基的序列的过程 N末端氨基酸残基被异硫氰酸苯酯修饰 然后末端氨基酸残基被异硫氰酸苯酯修饰 然后 从多肽链上切下修饰的残基 再经层析鉴定 从多肽链上切下修饰的残基 再经层析鉴定 余下的多肽链 少了一个残基 被回收再进行余下的多肽链 少了一个残基 被回收再进行 下一轮降解循环 下一轮降解循环 4 与与异硫氰酸苯酯异硫氰酸苯酯的反应的反应 5 与 与亚硝酸亚硝酸的反应的反应 NH2OH R CH COOH HNO2R CH COOH N2 H2O 氨基酸定量和蛋白质水解程度的测定 氨基酸定量和蛋白质水解程度的测定 Van Slyke 法测氨基氮 体积 的基础 法测氨基氮 体积 的基础 N2中的中的1 21 2为氨基氮 为氨基氮 脯氨酸脯氨酸无游离的无游离的 氨基 不发生该反应 氨基 不发生该反应 与 与荧光胺荧光胺的反应的反应 反应在反应在室温下 氨基酸可与室温下 氨基酸可与荧光胺荧光胺反应产生具有荧反应产生具有荧 光的产物 用激发波长光的产物 用激发波长390nm 发射波长 发射波长475nm测定测定 产物的荧光强度 此反应的灵敏度很高 产物的荧光强度 此反应的灵敏度很高 可检测可检测ng 水平的氨基酸水平的氨基酸 O O O O RC H COOH NH2 O R CH COOHN HO 荧光胺荧光产物 一一 氨基氨基参加的反应参加的反应 二二 羧基羧基参加的反应参加的反应 三三 羧基羧基和和 氨基氨基都参加的反应都参加的反应 四四 侧链侧链R基基参加的反应参加的反应 氨基酸的化学反应 其它 氨基酸的化学反应 其它 R COOH R COO C O H2N CH C N CH H R H R 醛醛氨基酸氨基酸Schiff s碱碱 H20 H20 形成形成Schiff s碱反应碱反应 氨基氨基参加参加 某些酶促反应的中间产物某些酶促反应的中间产物 如转氨如转氨反应反应 在在生物体内经生物体内经AA氧化酶氧化酶催化即催化即脱去脱去 氨基氨基而转变为而转变为酮酸酮酸 脱氨基反应脱氨基反应 氨基氨基参加参加 生物体内氨基酸分解代谢的第一步生物体内氨基酸分解代谢的第一步 氨基参加的反应及其应用氨基参加的反应及其应用 1 1 与亚硝酸反应与亚硝酸反应 2 2 酰基化和烃基化反应酰基化和烃基化反应 3 3 形成形成SchiffSchiff s s碱反应碱反应 4 4 脱氨基反应脱氨基反应 5 5 与甲醛的反应与甲醛的反应 aaaa定量定量 保护氨基 测保护氨基 测N N末端末端 中间代谢产物中间代谢产物 aaaa分解代谢分解代谢 aaaa定量定量 Pr Pr水解程度水解程度 二 二 羧基参加的反应羧基参加的反应 1 1 成盐或成酯反应成盐或成酯反应 2 2 成酰氯反应成酰氯反应 3 3 脱羧基反应脱羧基反应 4 4 叠氮反应叠氮反应 2 成酯 成酯 与醇反应与醇反应 NH2干燥 干燥 HCl R CH COOH C2H5OH 回流回流 R CH COOC2H5 H2O NH3 Cl 保护羧基保护羧基 1 与 与NaOH等形成盐等形成盐 略略 保护羧基 氨基的化学性质加强 用于蛋白质保护羧基 氨基的化学性质加强 用于蛋白质 的人工合成的人工合成 1 成盐或成酯反应成盐或成酯反应 HN 保护基保护基 R CH COOH PCl5 HN 保护基保护基 R CH COCl POCl3 HCl 保护氨基 活化羧基 人工肽的合成保护氨基 活化羧基 人工肽的合成 酰化氨基酸酰化氨基酸 2 成酰氯的反应成酰氯的反应 酰化氨基酸酰氯酰化氨基酸酰氯 NH2脱羧酶脱羧酶 R CH COOH R CH2 NH2 CO2 发酵法生产氨基酸测定氨基酸含量 发酵法生产氨基酸测定氨基酸含量 3 脱羧反应脱羧反应 YNH O R CH C OCH3 YNH O R CH C NHNH2 YNH O R CH C N N N 2H2O 酰化氨基酸甲酯酰化氨基酸甲酯 肼肼 酰化氨基酰肼酰化氨基酰肼 酰化氨基酰叠氮酰化氨基酰叠氮 活化羧基 肽的人工合成活化羧基 肽的人工合成 4 叠氮反应叠氮反应 HNO2 NH2NH2 1 1 成成盐盐或成酯反应或成酯反应 2 2 成酰氯反应成酰氯反应 3 3 脱羧基反应脱羧基反应 4 4 叠氮反应叠氮反应 保护羧基保护羧基 活化羧基活化羧基 aaaa分解代谢分解代谢 活化羧基活化羧基 羧基参加的反应及其应用羧基参加的反应及其应用 三 三 羧基和羧基和 氨基都参加的反应氨基都参加的反应 1 1 与与茚三酮反应茚三酮反应 2 2 成肽成肽反应反应 2 成肽 成肽反应反应 四 四 侧链侧链R基参加的反应基参加的反应 1 1 TyrTyr 2 2 碱性 碱性AAAA2 2 CysCys的巯基的巯基 O NH2 OH OH I I O NH2 OH OH I O NH2 OH OH O2N NO2 O NH2 OH OH NO2 1 Tyr酚基在酚基在3和和5位上易发生亲电取代位上易发生亲电取代 反应反应 如碘化和硝化如碘化和硝化 黄色反应黄色反应 1 1 TyrTyr NN NN O NH2 OH OH HO3S HO3S 2 Tyr的的Pauly反应反应 Tyr与重氨苯磺酸结合生成桔黄色化合物 与重氨苯磺酸结合生成桔黄色化合物 用于检测用于检测Tyr 1 1 TyrTyr 2R SH 1 2O2R S S R H2O 1 SH氧化生成氧化生成 S S Cys的巯基不稳定 易被氧化成二硫键的巯基不稳定 易被氧化成二硫键 巯基在有痕量的金属离子如 巯基在有痕量的金属离子如 Cu2 Fe2 Co2 或或Mn2 时 易被氧化时 易被氧化 2 2 CysCys的巯基的巯基 2 S S 氧化或还原成氧化或还原成 SH Cys中的二硫键可被氧化剂 过甲酸 以及还原剂中的二硫键可被氧化剂 过甲酸 以及还原剂 巯基化合物 打开 巯基化合物 打开 H2N CH COOH CH2 S S CH2 H2N CH COOH 6HCOOOH H2N CH COOH CH2 SO3H H2N CH COOH CH2 SH 2R SH 6HCOOH R S S R 磺基丙氨酸磺基丙氨酸 2 2 CysCys的巯基的巯基 氨基酸混合物的分析分离氨基酸混合物的分析分离 利用利用AAAA成分分配系数的差异成分分配系数的差异 一 分配层析法的一般原理 一 分配层析法的一般原理 层析系统层析系统 固定相固定相 流动相流动相 附着在固相上的液体附着在固相上的液体 固体固体 按两相所处状态按两相所处状态分分 流动相流动相 液体液体气体气体 固固 定定 相相 液液 体体 液液层析液液层析气液层析气液层析 固固 体体 液固层析液固层析气固层析气固层析 柱柱固定相装于柱内固定相装于柱内 纸纸固定相是液体 吸附在滤纸上 将样品固定相是液体 吸附在滤纸上 将样品 点在纸上 用流动相展开点在纸上 用流动相展开 薄层薄层将有适当粘度的固定相涂在薄板上将有适当粘度的固定相涂在薄板上 薄膜薄膜与纸层析相似 与纸层析相似 纸用其它高分子有机吸附剂代替纸用其它高分子有机吸附剂代替 按操作形式按操作形式分分 吸附吸附固体固体吸附能力不同吸附能力不同 分配分配液体液体分配系数不同分配系数不同 离子交换离子交换 离子交换剂离子交换剂亲和性不同亲和性不同 凝胶凝胶多孔凝胶多孔凝胶通过速度不同通过速度不同 亲和亲和固定相只能与一种组分结合 固定相只能与一种组分结合 分开其它无亲和力的组分分开其它无亲和力的组分 按层析原理按层析原理分分 固定相固定相各组分对固定相各组分对固定相 二 分配柱层析 二 分配柱层析 填充物为亲水性的不溶物质如纤维素 填充物为亲水性的不溶物质如纤维素 淀粉 淀粉 硅胶等 收集的组分用茚三酮硅胶等 收集的组分用茚三酮 显色定量 显色定量 三 纸层析 三 纸层析 One Dimensional 单向层析 Known Sample Y X Rf X Y Two Dimensional 双向层析 溶剂前沿 四 薄层层析 四 薄层层析 五 离子交换层析 五 离子交换层析 氨基酸自动分析仪原理 氨基酸自动分析仪原理 pH2 3时 时 AA带正电 与阳离子交换树脂结带正电 与阳离子交换树脂结 合合 升高升高pH和离子强度 和离子强度 AA依次洗脱 顺性为 依次洗脱 顺性为 酸性酸性AA 中性中性AA 碱性碱性AA 茚三酮显色茚三酮显色 六 气液层析 六 气液层析 固定相支持剂颗粒细 表面积大 固定相支持剂颗粒细 表面积大 采取高压 洗脱速度快 采取高压 洗脱速度快 七 高效液相层析 七 高效液相层析 小小 结结 氨基参