课题3　分解纤维素的微生物的分离.docx

专题2微生物的培养与应用课题3分解纤维素的微生物的分离1纤维素：是一种由葡萄糖首尾相连而成的高分子化合物，是地球上含量最丰富的多糖类物质。棉花是自然界中纤维素含量最高的天然产物。有些微生物能分解利用纤维素，因为它们能够产生纤维素酶。2纤维素酶：是一种复合酶，一般包括C1酶、CX酶和葡萄糖苷酶。C1酶和CX酶能使纤维素分解成纤维二糖，葡萄糖苷酶能将纤维二糖分解成葡萄糖。纤维素纤维二糖葡萄糖3筛选纤维素分解菌的方法是刚果红染色法。该方法可以通过颜色反应直接筛选。其原理是：刚果红可以与纤维素形成红色复合物，当纤维素被纤维素酶分解后，红色复合物无法形成，出现以纤维素分解菌为中心的透明圈，我们可以通过是否产生透明圈来筛选纤维素分解菌。4实验流程：土壤取样选择培养梯度稀释将样品涂布在鉴别纤维素分解菌的培养基上筛选产生透明圈的菌落选择培养的目的：增加纤维素分解菌的浓度，以确保能够从样品中分离所需要的微生物。5纤维素分解菌大多分布在富含纤维素的环境中，也可以将富含纤维素的物质埋在土壤中，经过30天左右，再从已腐烂的物质埋藏处筛选纤维素分解菌。6在将样品稀释涂布到鉴别纤维素分解菌的培养基上之前，可以用选择培养基增加纤维素分解菌的浓度。培养时要在摇床上振荡培养。7常用的刚果红染色法有两种：一种是先培养微生物，再加入刚果红染色；另一种是在倒平板时就加入刚果红。8经过刚果红鉴别培养基培养后，在产纤维素酶的菌落周围会出现透明圈。可以用单细胞挑取法挑取纤维素分解菌。9为确定得到的是纤维素分解菌，尚需进行发酵产纤维素酶的实验，纤维素酶的发酵方法有液体发酵和固体发酵两种。纤维素酶的测定方法一般采用对纤维素酶分解滤纸等纤维素后所产生的葡萄糖进行定量测定。课本P28旁栏思考题1本实验流程与课题2中的实验流程有哪些异同？本实验流程与课题2的流程的区别如下：课题2是将土样制成的菌悬液直接涂布在以尿素为惟一氮源的选择性培养基上，直接分离得到菌落。本课题通过选择培养，使纤维素分解菌得到增殖后，再将菌液涂布在选择培养基上。其他步骤基本一致。2为什么要在富含纤维素的环境中寻找纤维素分解菌？由于生物与环境的相互依存关系，在富含纤维素的环境中，纤维素分解菌的含量相对提高，因此从这种土样中获得目的微生物的几率要高于普通环境。3将滤纸埋在土壤中有什么作用？你认为滤纸应该埋在土壤中多深？将滤纸埋在土壤中能使纤维素分解菌相对聚集，实际上是人工设置纤维素分解菌生存的适宜环境。一般应将滤纸埋于深约10cm左右的腐殖土壤中。课本P29选择培养（1）选择培养的目的：增加纤维素分解菌的浓度，以确保能够从样品中分离所需要的微生物。（2）制备选择培养基：（3）操作：将土样加入装有30ml选择培养基的锥形瓶中，将锥形瓶固定在摇床上，在一定温度下震荡培养12天，直至培养液变浑浊。也可重复选择培养。回答下列问题：1旁栏中的配方（表1）是液体培养基还是固体培养基？为什么？是液体培养基，原因是配方中无凝固剂（琼脂）。2这个培养基对微生物是否具有选择作用？如果具有，是如何进行选择的？有选择作用，本配方中纤维素作为主要碳源，只有能分解纤维素的微生物可以大量繁殖。3你能否设计一个对照实验，说明选择培养基的作用？自变量为培养基的种类，即普通培养基和选择培养基。可用牛肉膏蛋白胨培养基与之对照，或者将纤维素改为葡萄糖。表1纤维素分解菌的选择培养基表2鉴别纤维素分解菌的培养基培养基组成含量提供主要的营养物质培养基组成提供的主要营养物质纤维素粉5g碳源（能源）CMC-Na510g碳源NaNO31g氮源、无机盐酵母膏1g碳源、氮源、生长因子KCl0.5g无机盐KH2PO40.25g无机盐Na2HPO47H2O1.2g土豆汁100mL碳源、生长因子KH2PO40.9g琼脂15g凝固剂MgSO47H2O0.5g将上述物质溶解后，用蒸馏水定容至1000mL水酵母膏0.5g生长因子、碳源、氮源水解酪素0.5g氮素、生长因子将上述物质溶解后，用蒸馏水定容至1000mL水说明：分析“纤维素分解菌的选择培养基配方”可知，该配方中的酵母膏也能够提供少量的碳源，因此其他微生物也能在该培养基中生长繁殖。只不过，由于酵母膏的含量极少，因此，只有以纤维素为碳源的微生物才能大量繁殖。课本P29将样品涂布在鉴别纤维素分解菌的培养基上（1）制备鉴别培养基：鉴别纤维素分解菌的培养基（表2）（固体培养基）（2）涂布平板：将稀释度为104106的菌悬液各取0.1ml涂布到平板培养基上，30倒置培养。课本P29刚果红染色法方法一中NaCl溶液的作用？漂洗作用，洗去与纤维素结合不牢的刚果红，以免出现的透明圈不够清晰。（用这方法可以判断酶活力的大小，实际上刚果红是结合到培养基的多糖底物，但分解纤维素的细菌可以产生纤维素酶，能分解这个多糖底物成为单糖，这样刚果红就不能结合上去了，氯化钠溶液就可以使结合不牢的刚果红洗去，这样就留下大大小小的透明圈，大的透明圈当然分解纤维素的能就强。）课本P29旁栏思考题1想一想，这两种方法各有哪些优点与不足？你打算选用哪一种方法？染色法优点缺点方法一：先培养微生物，再加入刚果红颜色反应基本上是纤维素分解菌的作用操作繁琐，刚果红会使菌落之间发生混杂方法二：倒平板时加入刚果红操作简便，不存在菌落混杂问题1、产生淀粉酶的微生物也产生模糊透明圈2、有些微生物能降解色素，形成明显的透明圈。2为什么选择培养能够“浓缩”所需的微生物？在选择培养的条件下，可以使那些能够适应这种营养条件的微生物得到迅速繁殖，而那些不适应这种营养条件的微生物的繁殖被抑制，因此可以起到“浓缩”的作用。课本P29练习2学完这个专题后，你能否总结出分离培养微生物的一般方法？请用流程图表示。流程图表示如下：土壤取样选择培养（此步是否需要，应根据样品中目的菌株数量的多少来确定）梯度稀释将菌悬液涂布到有特定选择作用的培养基上挑选单菌落发酵培养纤维素分解菌与分解尿素的细菌选择和鉴别知识的比较比较项目分解尿素的细菌纤维素分解菌选择培养基原理将细菌涂布在尿素为惟一氮源的选择培养基上将细菌涂布在以纤维素粉为主要碳源的选择培养基上培养基类型固体培养基液体培养基目的筛选菌株，分离出分解尿素的细菌选择培养，增加纤维素分解菌的浓度鉴别培养基原理在细菌分解尿素的化学反应中，细菌合成的脲酶将尿素分解成了氨，氨会使培养基的碱性增强，pH升高。在培养基中加入酚红指示剂，