人教版选修3 多聚酶链式反应扩增DNA片段 课件(25张).ppt

课题2多聚酶链式反应扩增dna片断 1 概念 pcr即 是一种体外迅速扩增dna片段的技术 它能以极少量的 为模板 在短时间内复制出上百万份的dna拷贝 多聚酶链式反应 dna 遗传疾病的诊断 刑侦破案 古生物学 基因克隆dna序列测定 2 pcr技术的应用 一 基础知识 一 回忆dna的复制回答相关问题 1 发生时间 发生在细胞有丝分裂的间期和减数第一次分裂间期 2 特点 方式 边解旋边复制 半保留复制 多起点复制 3 合成条件 模板 原料 游离的脱氧核苷酸 dna两条链 能量 atp 酶 解旋酶 dna聚合酶 反应条件温和 4 场所 细胞核 主 线粒体 叶绿体 dna母链 提供复制的模板解旋酶 打开dna双链4种脱氧核苷酸 合成子链的原料dna聚合酶 催化合成dna子链atp 为复制过程提供能量引物 使dna聚合酶从引物的3 端开始连接脱氧核苷酸 二 dna复制的条件 脱氧核苷酸结构 1 dna的平面结构 碱基 脱氧核糖 磷酸基团 碱基 脱氧核糖 碱基 脱氧核糖 5 3 磷酸二酯键 dna3 端 5 端指什么 dna的羟基 oh 末端称为3 端 而磷酸基团的末端称为5 端 脱氧核苷酸链结构 5 端含磷酸基团 3 端含羟基 3 端 5 端 dna聚合酶的特性 专一性 dna聚合酶不能从头开始合成dna 而只能从3 端延伸dna链 因此 dna复制需要引物 观察图2复制的方向 2方向 子链的5 端向3 端延伸 1 dna分子的热变性原理 dna双链 单链 变性 加热80 100 复性 缓慢冷却 变性的目的 解开双链 解开氢键 在80 100 的温度范围内 dna的双螺旋结构将解体 双链分开 这个过程称为 2 pcr原理 变性 高温解决了打开双链的问题 但是 又导致dna聚合酶失活的问题 耐高温的taqdna聚合酶解决了高温导致dna聚合酶失活的问题 促成了pcr技术的自动化 2 taqdna聚合酶的应用 3 pcr反应的条件 dna模板 分别与两条模板链相结合的两种引物 引物 和引物 四种脱氧核苷酸 耐高温的聚合酶 taqdna聚合酶 控制温度 但不需解旋酶 需要在一定的缓冲液中进行 pcr反应需要的这些条件的原因是什么 时间 min 温度 适温延伸 高温变性 低温复性 重复1 3步30轮 1 步骤 变性 复性 延伸 二 pcr的反应过程 变性95oc 5 引物1 5 引物2 5 5 模板dna 25 30次循环 复制 后 模板dna的含量可以扩大100万 220 倍以上 2 pcr的反应结果 从第二轮循环开始 上一次循环的产物也作为模板参与反应 并且由引物 延伸而成的dna单链会与引物 结合 进行dna的延伸 dna聚合酶只能特异性地复制处于两个引物之间的dna序列 使这段固定长度的序列呈指数扩增 三 pcr反应的实验操作 1 pcr仪 设备及用具 2 微量离心管 一种薄壁塑料管 总容积为0 5ml 3 微量移液器 用于定量转移pcr配方中的液体 其上的一次性吸液枪头用一次更换一次 实质上一台能够自动调控温度的仪器 三 pcr反应的实验操作 1 按配方将所需试剂摆放在实验桌上 准备 2 用微量移液器按配方在微量离心管中依次加入各组分 移液 3 盖严离心管口的盖子 用手指轻轻弹击管壁 混合 4 将微量离心管放在离心机上 离心 5 将离心管放入pcr仪上 设置好pcr仪的循环程序 反应 pcr技术高度灵敏 为了避免外源dna等因素的污染而造成干扰实验 pcr操作时要注意做到 6 注意事项 隔离操作区 所用微量离心管 枪头 缓冲液以及蒸馏水等在使用必须进行高压灭菌 分装试剂 简化操作程序 使用一次性枪头 四 结果分析与评价 dna含量的测定 稀释 对照调零 测定 计算 dna含量 g ml 50 260nm的读数 稀释倍数 波长260nm处读数 蒸馏水做对照 50倍 一 理论上dna扩增数目的计算 四 课题成果评价 1 一条dna 复制n次 dna为2n 2 a条dna 复制n次 dna为ax2n 二 实验中dna含量的测定 1 原理 可以通过测量dna含量来评价扩增的效果 dna在260nm的紫外线波段有一强烈的吸收峰 峰值的大小与dna的含量有关 五 课题延伸 例如 pcr产物每轮循环增加一倍 30轮循环扩增量