研究生实验测序引物设计方法介绍及注意事项.ppt

测序引物设计方法介绍及注意事项 一 PCR引物设计方法 1 引物最好在模板cDNA的保守区内设计 DNA序列的保守区是通过物种间相似序列的比较确定的 在NCBI上搜索不同物种的同一基因 通过序列分析软件 比如DNAman 比对 Alignment 各基因相同的序列就是该基因的保守区 2 引物长度一般在15 30碱基之间 引物长度 primerlength 常用的是18 27bp 但不应大于38 因为过长会导致其延伸温度大于74 不适于TaqDNA聚合酶进行反应 3 引物GC含量在40 60 之间 Tm值最好接近72 GC含量 composition 过高或过低都不利于引发反应 上下游引物的GC含量不能相差太大 另外 上下游引物的Tm值 meltingtemperature 是寡核苷酸的解链温度 即在一定盐浓度条件下 50 寡核苷酸双链解链的温度 有效启动温度 一般高于Tm值5 10 若按公式Tm 4 G C 2 A T 估计引物的Tm值 则有效引物的Tm为55 80 其Tm值最好接近72 以使复性条件最佳 4 引物3 端要避开密码子的第3位 如扩增编码区域 引物3 端不要终止于密码子的第3位 因密码子的第3位易发生简并 会影响扩增的特异性与效率 5 引物3 端不能选择A 最好选择T 引物3 端错配时 不同碱基引发效率存在着很大的差异 当末位的碱基为A时 即使在错配的情况下 也能有引发链的合成 而当末位链为T时 错配的引发效率大大降低 G和C错配的引发效率介于A T之间 所以3 端最好选择T 6 碱基要随机分布 引物序列在模板内应当没有相似性较高 尤其是3 端相似性较高的序列 否则容易导致错误引发 Falsepriming 降低引物与模板相似性的一种方法是 引物中四种碱基的分布最好是随机的 不要有聚嘌呤或聚嘧啶的存在 尤其3 端不应超过3个连续的G或C 因这样会使引物在GC富集序列区错误引发 7 引物自身及引物之间不应存在互补序列 引物自身不应存在互补序列 否则引物自身会折叠成发夹结构 Hairpin 使引物本身复性 这种二级结构会因空间位阻而影响引物与模板的复性结合 引物自身不能有连续4个碱基的互补 两引物之间也不应具有互补性 尤其应避免3 端的互补重叠以防止引物二聚体 Dimer与Crossdimer 的形成 引物之间不能有连续4个碱基的互补 引物二聚体及发夹结构如果不可避免的话 应尽量使其 G值不要过高 应小于4 5kcal mol 否则易导致产生引物二聚体带 并且降低引物有效浓度而使PCR反应不能正常进行 8 引物5 端和中间 G值应该相对较高 而3 端 G值较低 G值是指DNA双链形成所需的自由能 它反映了双链结构内部碱基对的相对稳定性 G值越大 则双链越稳定 应当选用5 端和中间 G值相对较高 而3 端 G值较低 绝对值不超过9 的引物 引物3 端的 G值过高 容易在错配位点形成双链结构并引发DNA聚合反应 不同位置的 G值可以用Oligo6软件进行分析 9 引物的5 端可以修饰 而3 端不可修饰 引物的5 端决定着PCR产物的长度 它对扩增特异性影响不大 因此 可以被修饰而不影响扩增的特异性 引物5 端修饰包括 加酶切位点 标记生物素 荧光 地高辛 Eu3 等 引入蛋白质结合DNA序列 引入点突变 插入突变 缺失突变序列 引入启动子序列等 引物的延伸是从3 端开始的 不能进行任何修饰 3 端也不能有形成任何二级结构可能 10 扩增产物的单链不能形成二级结构 某些引物无效的主要原因是扩增产物单链二级结构的影响 选择扩增片段时最好避开二级结构区域 用有关软件 比如RNAstructure 可以预测估计mRNA的稳定二级结构 有助于选择模板 实验表明 待扩区域自由能 G 小于58 6lkJ mol时 扩增往往不能成功 若不能避开这一区域时 用7 deaza 2 脱氧GTP取代dGTP对扩增的成功是有帮助的 11 引物应具有特异性引物设计完成以后 应对其进行BLAST检测 如果与其它基因不具有互补性 就可以进行下一步的实验了 值得一提的是 各种模板的引物设计难度不一 有的模板本身条件比较困难 例如GC含量偏高或偏低 导致找不到各种指标都十分合适的引物 用作克隆目的的PCR 因为产物序列相对