免疫学微生物学检验(高护2014)

1,临床免疫学实验诊断,实验诊断学,卫蓓文交通大学医学院 检验系Email: 63846590-776469,2,概述：免疫与疾病,3,免疫检验可分为两部分： 一部分为利用免疫检测原理与技术检测免疫活性细胞、抗原、抗体、补体、细胞因子、细胞粘附分子等免疫相关物质； 另一部分是利用免疫检测原理与技术检测体液中微量物质如激素、酶、血浆微量蛋白、血液药物浓度、微量元素等。,临床免疫学与免疫检验,免疫学技术的发展史,5,一、血清IgG、IgA、IgM 测定,IgG是血清中含量最高的免疫球蛋白，是血液和细胞外液中的主要抗体，也是机体再次免疫的主要抗体。成人5.6517.65g/L。 IgA分为血清型和分泌型，是参与黏膜局部免疫的主要抗体，主要存在于胃肠道和支气管分泌液、初乳、唾液和泪液中。成人0.4 3.5g/L。 IgM是分子量最大的免疫球蛋白，是个体发育过程中最早合成和分泌的抗体，也是抗原刺激诱导的体液免疫应答中最早出现的抗体。成人0.53.0g/L。,6,测吸光度计算抗原或抗体的含量,抗体,抗原,免疫复合物的浓度与透射光的衰减呈正相关,免疫比浊法原理,7,血清IgG、IgA、IgM测定的临床意义,低Ig血症:先天性低Ig血症（免疫缺陷病） 获得性低Ig血症(蛋白丢失) 高Ig血症:多克隆Ig增高（感染） 单克隆Ig增高（免疫增殖病）,8,血清IgD、IgE测定,正常人血清中IgD含量很低，膜结合型IgD(mIgD)构成BCR，是B细胞分化发育成熟的标志。 IgE是正常人血清中含量最少的免疫球蛋白，主要由黏膜下淋巴组织中的浆细胞分泌，为亲细胞抗体，引起I型超敏反应；与机体抗寄生虫免疫也可能有关。成人0.1 0.9mg/L。,9,ELISA,原理（Principle）：将抗原或抗体结合到某固相载体表面，保持其免疫活性，测定时,把被测样品和结合物按不同的步骤与固相载体上的包被物反应。用洗涤的方法使与固相载体上形成的免疫复合物与其他物质分开，再加入酶反应底物，经酶的催化作用后底物变为有色产物。产物的量与标本中被检物的量直接相关。,间接法,间接法检测抗体,11,双抗夹心法示意图,双抗体夹心检测抗原,13,血清IgD临床意义,IgD：生物功能不详 增高：类风湿性关节炎、变态反应性疾病、 败血症、新生儿溶血病 降低：意义不大,14,血清IgE临床意义,增高：变态反应性疾病、寄生虫感染、病毒感染、自身免疫性疾病。 降低：意义不大,15,二、血清补体检查,补体： 具酶样活性、不耐热的糖蛋白 其存在与抗原性异物的刺激无关 在正常人血清中含量相对稳定 某些疾病时，含量及其活性可发生改变,16,补体总活性测定方法是以红细胞的溶解为指示，以50%溶血为判断终点，称为CH50。,17,(图)血管神经性水肿,补体含量和活性相关的疾病,1免疫相关性疾病：如自身免疫性疾病时，C1、C2、C3、C4和Hf等缺陷；超敏反应时（III型超敏反应），C3a、C5a等过敏毒素的产生。2与补体有关的遗传性疾病： C2、C3缺陷导致的严重感染； 与C1抑制物缺陷相关的遗传性血管神经性水肿 SLE患者出现的细胞表面CR1缺陷与C1C清除障碍 涉及I因子、H因子缺陷的肾小球肾炎； DAF缺陷引起的阵发性血红蛋白尿； C1q缺陷表现的严重顽固性皮肤损害，以及C1q、C1r、C4、C2缺陷造成的 免疫复合物性血管炎（包括肾炎）等。,18,3补体含量显著降低的疾病：消耗增多:免疫复合物形成导致的补体活化和消耗增多.如SLE.补体的大量丢失:主要见于大面积烧伤、失血及肾脏病患者补体合成不足:常见于肝脏疾病患者或营养不良的病人。4高补体血症：偶见于感染恢复期和某些恶性肿瘤患者，正常妊娠时，也可观察到补体值的增高。,19,三、感染性疾病免疫学诊断,（一）病毒性肝炎（二）细菌感染（三）病毒感染（四）真菌感染（五）其他,20,（一）病毒性肝炎,甲型肝炎 乙型肝炎丙型肝炎丁型肝炎戊型肝炎,21,1. 甲型肝炎病毒,22,0,1,2,3,4,5,6,7,8,9,10,11,12,13,Week,Response,Clinical illness,ALT,IgM,IgG,HAV in stool,Infection,Viremia,EVENTS IN HEPATITIS A VIRUS INFECTION,23,无论显性感染还是隐性感染 均能产生抗-HAV的 IgM和IgG抗体,抗-HAV的IgM在急性期和恢复早期出现 阳性可作为甲肝的确诊依据,抗-HAV的IgG在恢复后期出现 有保护作用，维持终身,甲型肝炎免疫学检测,2.乙型肝炎病毒,25,26,乙型肝炎免疫学检测,HBV具有三个抗原抗体系统： HBsAg与抗-HBs HBeAg与抗-HBeHBc HBcAg与抗HBcAg,27,1) HBsAg和抗-HBs HBsAg是HBV感染后第一个出现的血清学标志物。HBsAg阳性见于急性肝炎、慢性肝炎或无症状携带者。持续6个月以上则认为转为慢性肝炎。在急性感染恢复期可检出抗-HBs，一般是在HBsAg从血清消失后发生抗-HBs血清阳转。,28,核心窗口期(core window):从HBsAg消失到抗-HBs出现的这段间隔期。此期可以短至数天或长达数月。抗-HBs是一种中和抗体，是乙肝痊愈的一个重要标志。抗-HBs对同型病毒的再感染具有保护作用，可持续数年。抗-HBs出现是HBsAg疫苗免疫成功的标志。,29,2) HBeAg和抗-HBe 是HBV复制及血清具有传染性的指标。在潜伏期与HBsAg同时或在HBsAg出现稍后数天可在血清中检出。HBeAg持续存在时间一般不超过10周，如超过则提示感染转为慢性化。,30,抗-HBe出现于HBeAg阴转后，其出现比抗-HBs晚但消失早。HBeAg阴转一般表示病毒复制水平降低，传染性下降，病变趋于静止。,31,3) HBcAg和抗-HBc HBcAg是HBV存在和复制活跃的直接指标。血液中的量微，不易检测到HBcAg。抗-HBc出现较抗-HBs早得多，早期以IgM为主，随后产生IgG型抗体。,32,抗-HBc IgM为急性HBV感染的指标，但慢性乙肝患者也可持续低效价阳性，尤其是病变活动时。急性感染恢复期和慢性持续性感染以IgG型抗-HBc为主，可持续存在数年。抗-HBc不是保护性抗体，不能中和乙肝病毒。,33,34,35,乙型肝炎病毒抗原抗体系统检测结果分析,36,前S1蛋白(pre-S1)/抗pre-S1:指位于HBV表面抗原蛋白1-120位氨基酸,具有肝细胞特异的糖蛋白受体的功能。 1.出现早,与HBeAg、HBV DNA显著相关; 2. pre-S1和肝细胞结合,有助于病毒的入侵; 3.干扰素疗效的标志; 4.抗pre-S1预示预后,37,3. 核酸检测 血清中存在HBV DNA是诊断HBV感染最直接的证据，可用定性的核酸杂交法、定量分支DNA(branched DNA，bDNA)杂交法、定性PCR法、荧光定量PCR法检测。HBV DNA检测可作为HBsAg阴性HBV感染者的的诊断手段，也有助于HBV感染者传染性大小的判断、HBV基因变异研究以及抗病毒药物临床疗效的评价等。但是HBV DNA阳性、及其定量检测的拷贝数目多少并不与肝脏病理损害程度呈相关关系，故不能用HBV DNA的多少判定病情程度。,38,思考题,患者一年前乙肝病毒感染血清标志的检测结果为,HBsAg(+), 抗-HBs(-), HBeAg(+), 抗-HBe(-), 抗-HBc IgM/IgG均(+), HBV DNA 4105拷贝/ml。治疗后此次复查结果为，抗-HBs（-），HBsAg（-），抗-HBe（-），HBeAg（-），抗-HBcIgM（-）/IgG（+），HBV DNA 6106拷贝/ml。其原因最可能是A. 乙肝恢复期B. 病毒发生变异C. 试剂盒失效D. 操作失误E. 抗病毒治疗有效,39,3. 丙型肝炎免疫学检测,免疫学：筛选试验 ELISA、放射免疫法抗HCV IgG或IgM。抗HCV IgM早期诊断。确证 免疫印迹法,40,根据与HBV感染的关系，可将HDV感染分为两种类型：1. 同步感染(coinfection) 指与HBV同时或先后感染。同步感染可引起典型的急性病毒性肝炎，个别病例易发展为危及生命的重症肝炎。2. 重叠感染(superinfection) 指在慢性HBV感染的基础上发生HDV感染。在重叠感染中，HDV复制水平较高，极易导致慢性乙型肝炎患者症状加重和慢性化，与肝硬化的发生也密切相关。,4.丁型肝炎免疫学检测,41,丁型肝炎免疫学检测,1）HDV抗原 2）抗HDV IgM 3）抗HDV,42,HBV - HDV Coinfection,Typical Serologic Course,Time after Exposure,Titer,anti-HBs,Symptoms,ALT Elevated,Total anti-HDV,IgM anti-HDV,HDV RNA,HBsAg,HBV - HDV Superinfection,Typical Serologic Course,Time after Exposure,Titer,Jaundice,Symptoms,ALT,Total anti-HDV,IgM anti-HDV,HDV RNA,HBsAg,44,5.戊型肝炎免疫学检测,抗体检测IgM型：诊断指标，ELISA法IgG型：双份血清，流行病学调查、既往感染或疫苗接种效果评价病毒抗原,45,（二）细菌感染免疫学诊断,人感染病原体产生特异性抗体可持续一段时间，现症诊断，疾病追溯。1.血清抗链球菌溶血素“O”试验：A群溶血性链球菌近期感染，活动性风湿热、风湿性关节炎、心肌炎、急性肾小球肾炎、急性上呼吸道感染、皮肤和软组织的感染等正常参考范围： 胶乳凝集法500U 免疫比浊法 200IU/ml,47,2、肥达反应 利用凝集试验，作为伤寒、副伤寒的辅助诊断。 正常参考范围： 伤寒O凝集效价 1:80 伤寒H凝集效价 1:160 副伤寒A.B.C 4倍，诊断价值较大。,48,3.结核分枝杆菌抗体和DNA测定： 结核菌致病可能与免疫损伤密切相关（型变态反应）呈显感染免疫（有菌免疫）。 免疫学检测：抗PPD-IgG （ELISA：阴性），结核菌素皮试（5mm15mm）。 DNA检测：PCR,49,（三）病毒感染,ToRCH 一组可通过宫内感染直接影响胎儿发育，并引起相似临床症状和体征如流产、或死胎、先天性畸形和智力低下等的感染因素。,50,“To”代表弓形体(toxplasma,TOX)“R”代表风疹病毒 (rubella virua,RV)“C”代表巨细胞病毒 (cytomegalovirus,CMV)“H”代表单纯疱疹病毒 (herps simplex virus,HSV),51,TORCH的应用,孕前(准备怀孕前双方)孕早期新生儿脐血幼儿时预防接种时,52,风疹病毒感染,53,婴幼儿风疹，俗称德国麻疹（German measles）由，风疹病毒所致。属于RNA病毒, 仅一种血清型。临床上大多数无症状(隐性感染), 少数显性 感染表现: 发烧 、躯体皮疹、枕后淋巴结肿胀。先天性风疹综合征(母婴垂直传播)。,54,先天性白内障(cataracts) 先天性心脏病(heart defects)神经性耳聋（sensorineural deafness）智力低下（mental retardation）,55,HSV-1型所致唇疱疹,56,57,巨细胞病毒感染的特点,1、感染广泛（2y，90%）2、隐性感染(obscure infection)3、潜伏感染(latent infection)4、多途径传播5、宿主的正常免疫功能起制约作用6、临床多见潜伏-再激活(reactive)7、呈多脏器侵犯,58,病毒抗原血症的检测,59,TORCH检测：IgM抗体出现均应做咨询。IgG抗体应注意滴度变化，滴度低且无变化为既往感染，双份血清滴度升高4倍以上。,60,（四）真菌感染免疫学诊断,意义有限,61,（五）其他感染免疫学诊断,性传播疾病：衣原体、支原体、梅毒螺旋体、淋球菌、HIV引起。 1 衣原体抗体测定 沙眼衣原体(CT)是引起性传播疾病常见的病原体之一。 IgM阳性提示近期有CT感染，有利于早期诊断 IgG在发病后68周出现，持续时间较长；提示曾有过CT感染,62,2 支原体血清学检测：肺炎支原体、解脲人原体、人型支原体和生殖道支原体。单份血清效价1：64128者或双份血清有4倍以上增长者，有诊断意义。3 梅毒螺旋体抗体测定梅毒诊治的参考指标: 非特异性试验：快速血浆反应素试验（RPR) 特异性试验：苍白螺旋体亚种血凝试验（TPHA）梅毒螺旋体反应素试验敏感性高；定性试验阳性的情况下，必须进行确诊试验，若阳性可确诊梅毒。,63,快速血浆反应素环状卡片试验(RPR)检测梅毒螺旋体 (正向间接),64,什么是肿瘤？为什么会发生肿瘤？,肿瘤是正常组织异常增生所形成的赘生物。按其所引起的后果不同可分为恶性和良性两种。,四、肿瘤标志物检测,实践表明，内在的遗传因素、免疫状态和外部的诱变因子，是构成肿瘤发生发展的基础和条件。 其中，机体的免疫状态，尤其是细胞免疫功能的强弱，已被视为是否发生肿瘤的重要内在因素。,65,肿瘤发病率和死亡率,WHO：每年肿瘤死亡人数为630万，至2020年， 全世界肿瘤患者将达1500万。我国：恶性肿瘤死亡率为108.39/10万，占死亡 人数17.94%，居死亡原因第二位。肿瘤的早期发现和早期治疗可明显提高患者生 存率。,临床：病史、体症,物理检查：X光、CT、磁共振、B超、红外、 核医学,术前：穿刺、刮片、拉网术后：组织切片,免疫：肿瘤抗原和代谢物测定,分子生物：肿瘤相关基因分析,肿瘤诊断,辅助,病理,67,肿瘤标志物的检测及临床意义,肿瘤标志物 由肿瘤细胞直接产生或由非肿瘤细胞经肿瘤细胞诱导后合成的物质。 检测血液或其他体液中的肿瘤标志物及细胞内或细胞表面的肿瘤标志物，根据其浓度有可能对肿瘤的存在、发病过程和预后做出判断。,68,常见肿瘤标志物及临床意义,1. 甲胎蛋白（-fetoprotein，AFP）,AFP是胎儿发育早期合成的一种糖蛋白(1球蛋白)，分子量70kD，胎儿出生后不久即逐渐消失。 参考值：血清AFP 300g/L，但有部分患者AFP始终不升高； 病毒性肝炎与肝硬化患者，血清中AFP可有不同程度的增高，但一般在300g/L以下； 生殖系统肿瘤和胚胎性肿瘤，如睾丸癌、畸胎瘤等升高； 妊娠三个月后，血清AFP含量开始升高，分娩后三周恢复正常。若孕妇血清中AFP异常升高，应考虑有胎儿神经管缺损畸形的可能性。,70,71,正常浓度: 1000 肝细胞癌,AFP的含量变化与肝细胞癌,72,AFP在各类肝病中的阳性率,73,2. 癌胚抗原（carcino-embryonic antigen，CEA）1965年CEA发现于成人结肠癌组织中，分子量约为200kD，可溶性糖蛋白，主要存在于成人癌组织以及胎儿的胃肠管组织中，故名癌胚抗原，是一种广谱肿瘤标志物。参考值：血清CEA 5.0g/L,74,临床意义： 结肠癌、直肠癌、胰腺癌、肺癌、乳腺癌、胃癌，转移性恶性肿瘤也有不同程度的阳性率；在恶性肿瘤的随访，病情监测，疗效评价等方面有重要价值。 肠道息肉、憩室炎、结肠炎、肝硬化、肝炎、胰腺炎和肺部疾病也可有不同程度的升高； 吸烟者中约有33%的人CEA5g/L。,75,3.糖链抗原15-3 ( CA 15-3),CA15-3是一种乳腺癌相关抗原，属糖蛋白，分子量超过400kD，可用一对单克隆抗体（MAb115D8和MAbDF3）进行双抗体夹心法来识别。与CA15-3同类的多态性上皮粘蛋白抗原还有MCA，CA27-29，CA549等。参考值：血清CA15-328kU/L,76,临床意义： 乳腺癌，但在乳腺癌的早期阳性率较低约为30%，转移性乳腺癌阳性率可达80%； 其他恶性肿瘤，如肺癌，结肠癌，胰腺癌，卵巢癌，子宫 颈癌，原发性肝癌等，也有不同程度的阳性率； 肝脏，胃肠道，肺，乳腺，卵巢等非恶性肿瘤疾病，阳性率一般低于10%。,77,4. 糖链抗原125 ( CA 125),CA125是很重要的卵巢癌相关抗原，1981年Bast发现。CA125是一种大分子多聚糖蛋白。 参考值 ：血清CA 125 35kU/L,78,临床意义： 卵巢癌，阳性率约为61.4%。手术和化疗有效者CA 125水平很快下降，若有复发，CA 125升高可先于临床症状出现之前。 其他恶性肿瘤，如乳腺癌40%，胰腺癌50%，胃癌47%，肺癌41.4%，结肠直肠癌34.2%，其他妇科肿瘤43%。 非恶性肿瘤，如子宫内膜异位症，盆腔炎，卵巢囊肿，胰腺炎，肝炎，肝硬化等疾病也有不同程度升高。 妊娠早期，CA 125有升高。,79,5.糖链抗原19-9 (CA19-9),CA19-9是一种与胰腺癌，胆囊癌，结肠癌和胃癌相关的肿瘤标志物，又称胃肠癌相关抗原。 参考值：血清CA199 37 kU/L,80,临床意义： 胰腺癌，胆囊癌，胆管壶腹癌时，血清CA 19-9水平明显升高，阳性率约为74.9%，尤其是胰腺癌晚期病人，血清CA 19-9浓度。可达40万kU/L，是重要的辅助诊断指标； 胃癌，阳性率约为50%，结肠癌，阳性率约为60%； 急性胰腺炎，胆囊炎，胆汁淤积性胆管炎，肝硬化，肝炎等疾病，CA 19-9也有不同程度的升高，注意与恶性肿瘤的鉴别。,81,6. 前列腺特异性抗原 (PSA),PSA是一种由前列腺上皮细胞分泌的蛋白酶。在血清中PSA以两种生化形式存在： 一部分(5%40%)是以低分子量(33kD)的 游离PSA（f-PSA）形式存在； 大部分(60%90%)是以PSA和1抗糜蛋白酶、 2-巨球蛋白等结合的形式存在， 称复合PSA(c-PSA)。 总PSA（t-PSA）,包括血清中f-PSA和c-PSA。,82,参考值：血清 t-PSA 4.0 g/L， f-PSA 25 【注意事项】在采集病人的血标本前进行直肠指诊、前列腺按摩，导尿等，将会导致血清PSA升高，应注意避免。,83,临床意义： 前列腺癌患者升高，但大约25%患者，其PSA水平正常；而大约有50%的良性前列腺疾病患者PSA水平增高。为增加PSA对前列腺癌检测的敏感性和特异性，可使用PSA年龄特异性参考范围，PSA密度、PSA速率、f-PSA/t-PSA比值等。 前列腺肥大，前列腺炎和泌尿生殖系统的疾病，也可见血清PSA水平升高，故当PSA在4.0g/L10.0g/L的灰区时，须进行f-PSA和 f-PSA/t-PSA比值的测定。,84,NSE是烯醇化酶的一种同功酶，烯醇化酶同功酶根据，三个亚基的不同，可分为、和五种二聚体同功酶。 亚基组成的同功酶属神经元和神经内分泌细胞特有，故命名为神经元特异性烯醇化酶，NSE是一种酸性蛋白酶，参与糖酵解。肿癌组织糖酵解作用加强，细胞增殖周期加快，细胞内的NSE释放进入血液增多，导致此酶在血清内含量增高。 参考值：血清NSE15g/L,7. 神经元特异性烯醇化酶（NSE）,85,临床意义： 小细胞肺癌（SCLC）。可用于鉴别诊断，监测小细胞肺癌放疗、化疗后的治疗效果。 神经母细胞瘤，患者NSE水平异常增高， 而Wilms瘤则升高不明显，因此测定NSE的水平可用于上述疾病的诊断和鉴别诊断。 神经内分泌细胞肿瘤，如嗜铬细胞瘤，胰岛细胞瘤，甲状腺髓样癌，黑色素瘤，视网膜母细胞瘤等血清NSE也可增高。,86,肿瘤标志物的临床应用,1.恶性肿瘤高危人群的早期检测2.诊断中的应用3.预后评价4.治疗监测5.肿瘤复发的早期检测,87,1. 恶性肿瘤高危人群的早期检测,肿瘤标志物普查五项原则：应十分清楚该肿瘤的发病率该肿瘤标志物应能检测早期肿瘤该肿瘤的早期治疗比晚期治疗更经济有效测定方法的灵敏度、特异性和重复性良好普查所需费用能被接受,88,2. 诊断中的应用,（1）定位 肿瘤标志物基本上不能对肿瘤定位。 极少数肿瘤标志物如PSA具器官特异性，但不具肿瘤特异性。,89,（2）确诊,通常不能进行确诊。因为肿瘤标志物无足够的灵敏度，不能 排除假阴性结果。本周蛋白(多发性骨髓瘤）、AFP（肝 癌）、-HCG（绒毛膜癌）和降钙素（甲状腺C-细胞癌）等有助确诊。,90,（3） 分 期大多数肿瘤标志物与疾病分期有关，且浓度与肿瘤大小通常存在关联。但并不能根据个体测得值来判断肿瘤大小，也不能以肿瘤标志物浓度精确指示各期肿瘤，因为各期肿瘤的肿瘤标志物浓度范围极广。,91,3.治疗监测,肿瘤标志物评价治疗有效性方案(Beastall,1991无效：浓度与治疗前相比下降50%有效：浓度与治疗前相比下降90%,92,4. 预后评价,术前浓度增高，术后降低，表示这些肿瘤标志物对此肿瘤有预后价值。在病程监测过程中，肿瘤标志物的浓度增高或降低与疾病的预后密切相关。,93,5.肿瘤复发的早期检测,94,术后肿瘤标志物水平的变化,肿瘤标志物水平,95,肿瘤标志物的其它几个问题,正常参考范围的界定方法学不同而导致的结果的不统一肿瘤标志物的联合检测,96,肿瘤标志物的正常参考范围,目前通常以正常人群的95%的可信区间为正常参考范围，对于肿瘤标志物，由于双侧通常是无意义的，因此一般取右单侧 95%为正常参考范围。即有5%的正常人在检测时其值会超过正常参考范围，引起临床的假阳性结果。,97,肿瘤标志物的正常参考范围,研究表明，正常参考范围对于肿瘤标志物来讲是意义不大（1）阳性结果提示该病人罹患肿瘤的概率（2）阴性结果提示该病人不罹患肿瘤的概率,98,肺癌：NSE、CYFRA21-1、CEA乳腺癌：CA153、CEA肝癌：AFP、AFU、CEA、AKP同工酶胰腺癌：CA242、CA199、CA50卵巢癌：CA125、CEA、CA199、HCG联合应用可大大提高检出的灵敏度,肿瘤标志物的联合检测,99,五、自身免疫检测,自身免疫耐受遭到削弱或破坏时，机体免疫系统对自身成分发生免疫应答，产生了自身抗体 或自身反应性T淋巴细胞，这种现象称为自身免疫(autoimmunity)。当某种原因使自身免疫应答超过一定强度，导致机体发生病理改变和功能障碍，这种因机体免疫系统对自身成分发生免疫应答引起的疾病称为自身免疫性疾病(autoimmune disease,AID)。,100,（一）类风湿因子检测,RA: 是常见的关节及全身系统性自身免疫疾病，国内有 350400万病人，无有效治疗方法。,101,类风湿因子(rheumatoid factor,RF)是抗变性IgG的自身抗体，靶抗原是变性IgG的Fc段。该抗体无种属特异性，有IgG、IgM、IgD、IgA、IgE五种类型，主要为IgM型。RF能与人和动物变性IgG结合而不与正常IgG发生凝集反应。,102,（1）RF在RA、SLE等多种自身免疫性疾病患者中均可被检出。,临床意义,103,（2）RF滴度与RA患者临床表现呈正相关，IgM-RF效价80IU/ml并伴有严重关节功能障碍时通常提示患者预后不良。（3）IgG-RF与RA患者的滑膜炎、血管炎和关节症状密切相关，常伴随IgM-RF同时出现，在正常人及非RA患者中很难检出。（4）IgA-RF与RA患者关节症状的严重程度及骨质破坏有显著相关性。,104,（二）血清抗核抗体的检测,抗核抗体（ANA）广义地指抗细胞核内所有抗原成分的自身抗体的总和。其抗原不仅存在于细胞核内，也可以存在于细胞质或其他细胞器中。无种属特异性。,105,抗核抗体(antinuclear antibody,ANA)有IgG（大多数）、IgM、IgA类ANA阳性（高滴度）标志着自身免疫病存在的可能性，正常人群中（尤其老年人）也可出现低滴度的ANA阳性。,106,根据细胞核内靶抗原分子的分布和理化特性分为：抗DNA抗体抗组蛋白抗体抗可提取核抗原(extractable nuclear antigen ENA)抗体抗非组蛋白抗体抗核仁抗体抗细胞其他成分抗体,ANA的类型及其临床意义,108,间接免疫荧光法示意图,109,结果判断,均质型：抗不溶性DNP抗体、抗组蛋白抗体 高效价见于SLE、低效价见于RA、 传单、慢性肝脏疾病 周边型(核膜型)：抗dsDNA抗体， 几乎仅见于SLE 颗粒型(斑点型)：抗ENA抗体， MCTD(+) 核仁型：抗核小体抗体(抗RNA抗体)， 见于硬皮病,110,均质型,111,周边型,112,周边型 Hep-2细胞 猴肝细胞,113,斑点型,114,核仁型,115,1.抗双链DNA抗体(double stranded DNA,dsDNA),抗原基质：Hep-2细胞、绿蝇短膜虫靶抗原是细胞核中DNA的双螺旋结构，抗DNA抗体识别嘌呤和嘧啶碱基。抗ds-DNA抗体识别成双碱基对的DNA，同时可与天然或单链DNA反应。,116,Hep-2细胞：核浆均质性着染，有丝分裂细胞中染色质呈强均质性着染。绿蝇短膜虫：动基体强阳性均质性着染,117,对SLE有较高特异性，7090%活动性SLE患者该抗体阳性；抗体滴度与疾病的活动程度有相关性，抗体滴度的动态测定为监控治疗提供了有效的实验室手段。在类风湿性关节炎、混合性结缔组织病(mixed connective tissue disease MCTD)、干燥综合征(Sjogren syndrome)也可阳性；抗单链DNA(single stranded DNA,ssDNA)抗体特异性较差，可见于SLE等多种自身免疫病。,临床意义,118,2. 抗Sm抗体,Hep-2细胞,119,临床意义,是SLE的特异性标志，疾病特异度达99%，但在SLE中阳性率较低，仅为30%40%。,120,3.抗组蛋白抗体(anti-histonic tibody,AHA),组蛋白：是一种与DNA结合的富含赖氨酸和精氨酸的碱性蛋白，由H1、H2A、H2B、H3、H4五个亚单位组成。组蛋白常以四聚体形式存在，与ds-DNA相互作用形成复合物，组成核小体。抗原基质：Hep-2细胞荧光图型：核浆均质型，分裂期细胞染色质呈强着染。,121,在药物性狼疮患者中阳性率达90%100%，而SLE病人阳性率仅有20%35%，类风关病人为36%；不同类型的AHA有助于疾病发展的预测判断，如以IgG型AHA为主的SLE病人，其心包炎、肾炎、关节炎发生率高于以IgM型AHA为主的病人,临床意义,122,1.抗线粒体抗体 一组以线粒体内膜和外膜蛋白为靶抗原，具有非器官特异性和非种属特异性特点的自身抗体。,（三）抗组织细胞抗体检测,123,Hep-2:胞浆中产生一种清晰、粗颗粒荧光肾：在近曲小管、远曲小管细胞的特点是颗粒聚集成团,Hep-2细胞,肾,124,临床意义,M1:梅毒、干燥综合征M2:PBCM3:药物性SLEM4:PBC、慢性活动性肝炎M5:SLE、自免溶贫M6:药物性肝炎M8:PBC,125,2.抗甲状腺抗体,（1）抗甲状腺球蛋白抗体（2）抗甲状腺微粒体抗体,126,（1）抗甲状腺球蛋白抗体(thyroid-globulin antibody,TGA),主要见于： （1）自身免疫性甲状腺病 阳性率 淋巴细胞性甲状腺炎（桥本甲状腺炎） 36-100% 原发性黏液性水肿 72% Gravess病 50-98%（2）自身免疫性内分泌性病 糖尿病 20% Addisons病 28%（3）其它： 甲状腺癌 13-65% 非毒性甲状腺肿 8%,127,抗甲状腺球蛋白抗体,猴甲状腺,128,抗甲状腺微粒体抗体(thyroid microsomal antibody,TMA),是针对甲状腺微粒体有效抗原成分-过氧化物酶(thyroid peroxidase,TPO)的抗体。现大多数文献已将TMA改称为抗TPO抗体。该抗体主要见于： 自身免疫性甲状腺病 桥本甲状腺炎 85-100% Gravess病 65%器官特异性自身免疫病 型糖尿病 14% Addisons病 31% 恶性贫血 55% 产后甲状腺炎 15%,129,正常人也有一定的阳性率0-15%， 但滴度比甲状腺炎病人低。TGA和TMA联合测定，高于98%的甲状腺炎患者有针对其中一种或两种抗原的抗体。因此，阴性结果可以排除甲状腺炎的诊断。然而，阳性结果并不能排除如甲状腺肿瘤或甲状腺机能亢进的诊断。甲状腺自身抗体阳性是将来患自身免疫性甲状腺病的危险因子。,130,抗甲状腺微粒体抗体,猴甲状腺,131,3.抗心肌抗体(myocardial antibodies),临床意义：心肌炎、心肌衰竭、风湿热、重症肌无力、心肌病和心脏手术后患者均可测到抗心肌抗体。注：嗜异体抗体可引起非特异性肌纤维膜着染。AMA(+)时，心肌组织也可出现非特异性荧光着染。,没固定的的猴心脏冰冻切片,132,4.抗乙酰胆碱受体抗体(acetylcholine receptor,AchR),抗AchR抗体是重症肌无力患者的标志性自身抗体，且抗体水平与病情严重程度相关。,133,5.抗胰岛细胞抗体(pancreatic islet cell antibody,ICA),ICA多见于胰岛素依赖性糖尿病患者，检出率达60%70%。,134,6.抗肾小球基底膜抗体(glomerular basement membrane,GBM),见于急进型肾小球肾炎、免疫复合物型肾小球肾炎、狼疮性肾炎和Good-Pasture综合征等。,135,抗肾小球基底膜抗体,猴肾,136,7.抗胃壁细胞抗体(parietal cell antibody,PCA),90%的恶性贫血患者PCA为阳性，检测有助于恶性贫血与其它巨细胞性贫血的鉴别诊断。,猴胃,137,六、免疫增殖病检测,免疫器官、免疫组织、免疫细胞异常增殖引起的机体病理损伤。淋巴系统异常增殖所引起的疾病。浆细胞功能异常导致免疫球蛋白异常增殖性疾病；分为良性增殖病和恶性增殖病两大类疾病。,138,单克隆免疫球蛋白病,单株浆细胞异常增殖，产生大量理化性质十分均一的免疫球蛋白单克隆蛋白。尿中的免疫球蛋白轻链称本周蛋白。突出特点：患者血清存在异常增多的单克隆蛋白，理化性质十分均一，多无免疫活性，所以又称副蛋白。,139,单克隆免疫球蛋白病检验,血清蛋白区带电泳免疫电泳免疫固定电泳血清免疫球蛋白定量免疫球蛋白轻链型筛选本周蛋白检测,140,血清蛋白区带电泳,测定M蛋白的一种定性实验，常采用醋酸纤维素膜和琼脂糖电泳两种方法。 M蛋白在电泳时出现于区带中，不同类型的M蛋白的电泳后所处位置略有不同,141,血清蛋白区带电泳,142,免疫固定电泳,M蛋白在免疫固定电泳中显示狭窄而界限明确的区带，而多克隆增殖或正常血清球蛋白区带则比较弥散。,143,免疫固定电泳,144,七、免疫缺陷病检测,机体免疫系统由于先天性发育不全或后天获得性损伤导致机体的免疫功能降低或缺乏。临床表现为反复迁移性或机会性感染，自身免疫现象，某些肿瘤的发生率增高。两大类：原发性免疫缺陷性疾病 继发性免疫缺陷病,145,HIV检测,病毒标志检测：分离病毒组分免疫标志检测非特异性检测：T细胞亚群等,147,初筛（ELISA、IFA、RIA） 确证：免疫印迹试验,至少同时测两种抗体(P24、gp120)阳性,方可判断HIV感染,148,HIV抗体初筛检测流程图,149,HIV抗体确认实验结果,150,初筛检测阳性标本,两种初筛试剂,阴性报告,阴性报告,阴性反应,一阴一阳,阳性反应,免疫印迹法WB-1/2混合型,复核,报告HIV-2血清学阳性反应,必要时测核酸,阴性反应,可疑反应,HIV-2 阳性反应,免疫印迹法WB-2,阴性报告,出现gp36,阴性反应,可疑反应,HIV-1 阳性报告,HIV-1 阳性反应,每三个月随访一次，共两次，仍属可疑，判为阴性,HIV抗体确认实验流程图,151,CD4+T细胞绝对数量,152,八、超敏反应检测,是指已经致敏的机体再次接触相同的抗原或半抗原所引起的组织损伤或生理功能紊乱。,153,过敏原皮肤点刺试验,154,155,皮肤试验,型超敏反应皮内试验风团和红晕大小的分级法,级别 红晕（cm） 风团（cm）, 0.5 0.5 0.51.0 0.51.0 1.12.0 0.51.0 2.13.0 0.51.0 3.14.0 1.11.5，或有伪足 4.0 1.5，或有多个伪足,156,临床微生物学实验诊断,实验诊断学,157,一、 标本的采集和处理原则,（一）标本采集的一般原则1早期采集 2无菌采集 3根据目的菌的特性用不同的方法采集4采集适量标本 5安全采集,158,（二）标本的处理1. 对环境敏感的细菌如脑膜炎奈瑟菌、淋病奈瑟菌和流感嗜血杆菌等应保温并立即送检。2. 其他所有的标本采集后最好在2h之内送到实验室。3. 若不能及时送检，标本应置于一定环境中保存。4. 一般情况下，用于细菌培养的标本保存时间不应超过24h。,159,.病人标本中可能含有大量致病菌，必须注意安全防护。.标本切勿污染容器的瓶口和外壁，