生化实验设计完美版2

2010级本科分子生物学实验设计,案例： 患儿，男性，3岁，因面色苍白伴血尿1天入院。1天前食用新鲜蚕豆后，今日出现恶心、呕吐、排尿呈酱油样色，面色苍白。据家长反映，患者的姐姐也曾发生过类似情况。 体格检查：体温38(37.2 ），脉搏150次/分（75次/ 分），呼吸40次/分（20次/分），血压80/60mmHg（100120/ 6080mmHg ），呼吸急促，神清，萎靡，面色苍白，皮肤及巩膜黄染，体型较同龄人瘦小。心、肺未及异常，肝、脾未触及，双肾区无叩击痛，神经系统检查未及异常。,实验室检查： 红细胞 1.981012/L(新生儿:6.01012/L)血红蛋白 53g/L(儿童：110160g/L)血清总胆红 85.5mol/L（3.411.7mol/L）结合胆红素 13.7mol/L未结合胆红素71.8mol/L尿蛋白（+） 潜血(+) 尿胆红素() 尿胆素原(+) 尿液镜下未见红细胞,葡萄糖-6-磷酸脱氢酶缺陷症（俗称“蚕豆病”）,初步诊断,发病机理 红细胞葡萄糖-6-磷酸脱氢酶（G6PD）有遗传缺陷者在食用青鲜蚕豆或接触蚕豆花粉后皆会发生急性溶血性贫血症蚕豆病，致病机制尚未十分明了。已知有遗传缺陷的敏感红细胞，因G6PD的缺陷不能提供足够的NADPH以维持还原型谷胱甘肽（GSH）的还原性（抗氧化作用），在遇到蚕豆中某种因子后更诱发了红细胞膜被氧化，红细胞膜上的磷脂分子中的不饱和脂肪酸氧化生成过氧化脂质，损害细胞膜。G-6-PD有保护正常红细胞免遭氧化破坏的作用，新鲜蚕豆是很强的氧化剂，当G-6-PD缺乏时则红细胞被破坏而致病。,葡萄糖-6-磷酸脱氢酶与6-磷酸葡萄糖酸脱氢酶比值法,实验名称：,6-磷酸葡萄糖,6-磷酸葡萄糖脱氢酶,NADP+,NADPH+ +H+,6-磷酸葡萄糖酸,NADP+,NADPH+ +H+,6-磷酸葡萄糖酸脱氢酶,5-磷酸核酮糖,【原理】,葡萄糖-6-磷酸脱氢酶催化葡萄糖-6-磷酸转化为6-磷酸葡萄糖酸。红细胞溶解的溶血素中存在6-磷酸葡萄糖酸脱氢酶，可催化生成的6-磷酸葡萄糖酸进一步转化为5-磷酸核糖，这两步伴有NADP+还原为NADPH，通过NADP+ 还原为NADPH的速率与葡萄糖-6-磷酸脱氢酶的活性成比例。 由于葡萄糖-6-磷酸脱氢酶缺乏杂合子的葡萄糖-6-磷酸脱氢酶活性的范围较宽，用以上的葡萄糖-6-磷酸脱氢酶活性定量测定方法来检测葡萄糖-6-磷酸脱氢酶缺乏杂合子，检出率较低。6-磷酸葡萄糖酸脱氢酶缺乏极其罕见，其浓度和活性一般较稳定。因此在一般情况下，通过测定葡萄糖-6-磷酸脱氢酶和6-磷酸葡糖糖酸脱氢酶活性来计算葡萄糖-6-磷酸脱氢酶/6-磷酸葡糖糖酸脱氢酶比值，可以提高对葡萄糖-6-磷酸脱氢酶缺乏杂合子的检出率。,【试剂】 溶血素；1mol/LTris-盐酸缓冲液(含5mmol/L EDTA)，pH8.0；2mmol/L NADP溶液，蒸馏水，0.1mmol/L 氯化镁溶液； 6mmol/L葡萄糖-6-磷酸溶液；6mmol/L 6-磷酸葡萄糖酸溶液。【仪器】移液器,比色皿，紫外可见分光光度计， 1ml试管,【操作方法】（1）溶血素制备：红细胞酶活性测定用的溶血素为比容红细胞1体积溶于溶液19体积中。溶血素须新鲜配制，在4存放不宜超过8小时。（2）酶活性测定操作：本测定系统包括了主要测定葡萄糖-6-磷酸脱氢酶活性（测定1）；测定6-磷酸葡萄糖酸脱氢酶活性（测定2）和测定葡萄糖-6-磷酸脱氢酶和6-磷酸葡萄糖酸脱氢酶的总活性（测定3）3个方面。在1ml的测定系统中，试剂的浓度及用量及检测步骤：一对照管为基准，37恒温，340nm记录各测定管得吸光度变化（A）10分钟。如检查系统1ml，各试剂的用量应该按比例增加。,【计算结果】葡萄糖-6-磷酸脱氢酶活性IU/(2.81010)=（A/2.8）1010115.8. 式中，A为测定的吸光度变化值；Hb为血红蛋白浓度；115.8为根据本测定方法反应体系的总量，溶血素所含红细胞数量和NADPH的吸光系数，以每分钟的吸光度变化酶活性计算公式换算出的系数,注意事项操作过程中，注意试剂量的准确度，保持相同的酸碱度。反应试剂须使用前新鲜配制。【正常参考值】葡萄糖-6-磷酸脱氢酶/6-磷酸葡萄糖酸脱氢酶比值0.95.若34.2umol/L时，黄疸,血清总胆红素,结合胆红素变化不大（水溶性大，随尿排出）,未结合胆红素（水溶性小，不能随尿排出，有毒）,酱油尿,G-6-PD是红细胞葡萄糖磷酸戊糖旁路代谢中所必须的脱氢酶，它使6-磷酸葡萄糖释放H+，从而使辅酶（NADP）还原成还原型辅酶（NADPH）.NADPH是红细胞抗氧化的重要物质，它能使细胞内的氧化型谷胱甘肽（GSSG）还原成还原型的谷胱甘肽（GSH）和维持过氧化氢酶（CAT）的活性（如图）。CAT是过氧化氢（H2O2）还原成H2O的还原酶。 GSH的重要作用是： 保护红细胞内含硫氰基（-SH）的血红蛋白、酶蛋白和膜蛋白的完整性，避免H2O2对含-SH基物质的氧化 与谷胱甘肽过氧化酶（GSHpx）共同使H2O2还原成H2O，G-6-PD缺乏时，NADPH生成不足，CAT和GSH减少，因此，当机体受到氧化物侵害时作用产生的H2O2不能被及时还原成H2O，过多的H2O2作用于含-SH基的血红蛋白、膜蛋白和酶蛋白，致血红蛋白和膜蛋白均发生氧化损伤。血红蛋白氧化成交铁血红蛋白和变形珠蛋白小体，红细胞膜的过氧化损伤则致膜脂质和膜蛋白硫基的氧化。上述作用最终造成红细胞膜的氧化损伤和溶血。,体型体型瘦小与该疾病是否有关，为什么？,核酸（DNA,RNA）受影响