实验离体蛙心灌流

实验四 蛙类离体心脏灌流,【目的】1.学习斯氏离体蛙心灌流法2.观察K+、Ca2+及肾上腺素、乙酰胆碱等对离体心脏活动的影响。,【原理】,心肌具有自动节律性、传导性和兴奋性三大特征。离体和脱离神经支配的动物心脏,保持在适当的环境中,在一定的时间内,仍然能够有节律性地产生兴奋和收缩。利用心肌细胞的这一特性,可用来制作离体心脏模型,通过灌流液中营养物质、电解质等的变化,来观察心肌能量代谢、相应药物、毒素和电解质水平对心肌活动的影响。,【仪器与设备】,蟾蜍，蛙用手术器械，蛙心套管，蛙心夹，张力换能器，RM6240，任氏液，2%CaCl2，2%KCl，0.01%肾上腺素，0.01%乙酰胆碱。,三、实验内容与操作步骤,（一）离体蛙心灌流制作1.破坏蟾蜍脑和脊髓，暴露心脏，剪除心包膜和肝系膜（不要损伤血管）2.第1次结扎：双结扎右主动脉3.第2次结扎：结扎左右肺静脉、前腔静脉（远离静脉窦）,4.第3次结扎：在左右肝静脉和后腔静脉下穿线在右肝静脉（或左肝静脉、或后腔静脉）上用眼科剪剪一斜口用加有任氏液的蛙心套管静脉插管插入剪口结扎固定（远离静脉窦）,5. 第4次结扎：在左主动脉下穿线在动脉上剪一斜口插入动脉蛙心套管动脉插管（不要插入动脉球内） 结扎固定6. 在所有结扎处外缘远离心脏端剪除周围血管，将与蛙心套管静脉插管和动脉插管的离体蛙心固定在铁架台上,离体蛙心循环回路,静脉插管,动脉插管,橡胶连接管,蛙心灌流装置安装,通道1,受滴信号线,RM6240记录系统,点击“实验”菜单，选择“蛙心灌流”，系统进入信号记录状态。仪器参数：通道，时间常数：直流；滤波频率10Hz；灵敏度3g，采样频率400Hz，扫描速度1s/div。,实验项目,1.描记正常的蛙心搏动曲线，观察心跳频率，心室收缩和舒张程度。2.向套管的任氏液中加2%CaCl21滴，观察并记录心博曲线的变化。,实验项目,3.当心脏恢复正常时，向套管内加入2滴2%KCl溶液，观察心搏变化频率和幅度，当曲线出现明显变化时，立即更换任氏液。4.当心脏恢复正常时，向套管内加入1滴0.01%肾上腺素溶液，观察心搏变化频率和幅度，当曲线出现明显变化时，立即更换任氏液。5.当心脏恢复正常时，向套管内加入1滴0.01%乙酰胆碱溶液，观察心搏变化频率和幅度，当曲线出现明显变化时，立即更换任氏液。,【注意事项】,每次换液时液面应保持一定的高度。每次换液或滴加试剂时应打标记。每个试剂瓶的滴管不能混淆，以免沾污试剂，影响结果。心脏表面随时滴加任氏液，以免干燥。待心跳恢复正常后进行下一项实验。,表1 CaCl2、KCl 、肾上腺素和乙酰胆碱对心肌收缩力、心输出量和心率的影响,Ca2+作用机制：,1.使慢反应自率细胞0期去极化加强，传导性加强。2.慢反应自率细胞4期自动去极化速度加快，自率性加强。3.快反应工作肌细胞进入细胞内Ca2+多，心肌收缩力加强。,K+影响的机制：,1.心肌收缩力下降细胞外液ca2+、K+存在竞争性抑制关系， K+浓度升高时， ca2+内流减少，心肌细胞兴奋一收缩耦联作用减弱，心肌收缩力下降。2.心率减慢细胞外液K+浓度升高使膜对K+通透性升高，因此4相的K+外向电流增大，延缓了4相的净内向电流的自动除极化效应，使心肌细胞自律性下降，心率减慢。,肾上腺素作用机制：,心脏，肾上腺素与肾上腺素能受体结合产生正性变时、变力和变传导作用，导致心率加快，传导速度加快，使心输出量增加，心肌收缩力增强。激活心肌细胞膜上的腺苷酸还化酶，使细胞内 cAMP浓度增加，cAMP能激活心肌细胞膜上的钙通道，使心肌动作电位平台期的内流增加，心肌收缩力增强。,乙酰胆碱作用机制：,乙酰胆碱与心肌细胞膜上毒蕈碱型(M型)乙酰胆碱受体结合，导致心率减慢，心房肌收缩能力减弱，心房肌不应期缩短，房室传导速度减慢，即具有急性变时、变力及变传导作用。乙酰胆碱能普遍提高膜上K+通道的通透性，促使K+外流增加，从而使静息电位绝对值增大，心肌兴奋性下降，使心率减慢；复极加速，动作电位时程缩短，有效不应期缩短，由于乙酰胆碱能提高膜上K+通道的通透性，促使K+外流增加，复极加速，Ca2+内流量减少。加之乙酰胆碱可直接抑制Ca2+通道，减少内向Ca2+流的作用，致使心肌收缩能力下降。,【作业】,1.计算加入2滴2%KCl后的灌流液中K