肝衰竭机制和治疗研究进展

浙江大学医学院附属第一医院传染病诊治国家重点实验室,2008年5月10日,肝衰竭机制和治疗研究进展,李兰娟,内科学（传染病）国家重点学科 传染病诊治国家重点实验室,肝衰竭患者病情危重极度乏力，消化道症状，腹胀或腹水；黄疸进行性加深（TB171umol/L或每天上升17umol/L）；明显出血倾向，PTa40%；肝性脑病和/或肝脏进行性缩小。 肝细胞大片坏死,各种类型肝衰竭发病机制、关键物质尚未明确内科综合治疗：病死率达80 如何提高疗效是国际性难题,内科学（传染病）国家重点学科 传染病诊治国家重点实验室,肝衰竭的定义,肝衰竭是由多种因素引起肝细胞严重损害，导致其合成、解毒和生物转化等功能发生严重障碍，出现以黄疸、凝血功能障碍、肝性脑病和腹水等为主要表现的一种临床综合征,中华医学会感染病分会、肝病分会肝功能衰竭与人工肝学组. 肝功能衰竭诊疗指南. 中华传染病杂志.2006，24：422,我国肝衰竭诊疗指南已颁布,内科学（传染病）国家重点学科 传染病诊治国家重点实验室,肝衰竭的分类,中华医学会感染病分会、肝病分会肝功能衰竭与人工肝学组. 肝功能衰竭诊疗指南. 中华传染病杂志.2006，24：422,内科学（传染病）国家重点学科 传染病诊治国家重点实验室,肝衰竭的病因,中国病毒性肝炎为主,欧美药物 、酒精性为主,内科学（传染病）国家重点学科 传染病诊治国家重点实验室,肝衰竭的病理生理,发病机制、关键物质未明,阻断恶性循环的治疗措施有待改善,内科学（传染病）国家重点学科 传染病诊治国家重点实验室,肝 衰 竭 发 病 机 制,目前认为肝损伤导致肝衰竭发生的原因大致可以分为化学性损伤和免疫损伤两大类化学性损伤与在肝脏解毒的物质有毒性代谢产物相关，通过影响细胞膜、线粒体、胞内离子的稳定和各种降解酶类起作用。免疫性损伤和宿主自身免疫状态及其易感性、细胞毒性T细胞反应、巨噬细胞的激活、细胞因子、一氧化氮、补体等相关。,近年在应用代谢组学方法研究肝衰竭发病过程中未知关键物质及以内毒素为轴线的肠道微生态失衡和肝衰竭相关性等方面取得了诸多进展,内科学（传染病）国家重点学科 传染病诊治国家重点实验室,肠道微生态在肝衰竭 发生发展中的作用,肝衰竭发病机制研究进展,内科学（传染病）国家重点学科 传染病诊治国家重点实验室,微生态是人体的有机组成部分,人体正常菌群种类500余种 数量100万亿个（人体体细胞仅10万亿个） 平均重约1.5kg，相当于肝脏的重量 99.9%是以双歧杆菌和类杆菌为主的专性厌氧菌 0.1%是以肠杆菌科细菌为主的兼性厌氧菌,1g,1000g(80%),20g,200g,20g,10g,20g,内科学（传染病）国家重点学科 传染病诊治国家重点实验室,森林砍伐等 宏观生态破坏 洪水、沙漠化、沙尘暴等,宏观生态破坏,政府已高度重视,微观生态破坏,21世纪全球面临的新问题 亟需新理论、新方法,抗生素免疫抑制剂肝病等疾病,微生态失衡严重危害人体健康,微生态失衡,细菌耐药,难治性感染,肝衰竭等多器官功能不全,内科学（传染病）国家重点学科 传染病诊治国家重点实验室,Science, June 2005,308: 1635-1638,国际学界对肠道微生态的再认识,肠道微生物是人体提供营养，调控上皮发育和指导先天性免疫的不可缺少的“器官”,Paul Eckburg, Stanford UniversitySteven Gill, Karen Nelson, TIGR/VI,内科学（传染病）国家重点学科 传染病诊治国家重点实验室,微生态学研究技术平台的发展,Yu y, Sheng GP,et al J Proteom Res, 2007;6:2413-19,内科学（传染病）国家重点学科 传染病诊治国家重点实验室,感染微生态与肝病相关系列研究,动物模型研究（大鼠）急性肝衰竭模型（30只）肝脏缺血再灌注模型（36只）肝移植模型（80只）,临床研究慢性肝炎（30例）慢性重型肝炎患者（31例）肝硬化患者（51例）肝移植患者（113例）,采 样 ： 血、粪便、肝组织、肠道组织、肠系膜淋巴结等检测内容： 生化、内毒素、细胞因子、细菌培养、分子生态、组织病理及代谢组学,内科学（传染病）国家重点学科 传染病诊治国家重点实验室,研究发现慢性肝衰竭患者肠道菌群严重失衡,Li Lj，et al, Chin Med J . 2001:114(12):869-872,内科学（传染病）国家重点学科 传染病诊治国家重点实验室,研究发现肝病肠道微生态失衡与内毒素血症 密切有关,肠粘膜屏障损伤,肠道定植抗力,Li Lj，et al, Chin Med J . 2001:114(12):869-872；,Li LJ et al, WJG 2004; 10(14) :2087-2090,内科学（传染病）国家重点学科 传染病诊治国家重点实验室,Chen CL,et al. J Infect 2007;54:98-102 Li Lj，et al, Chin Med J . 2001:114(12):869-872 Li Lj et al.World J Gastroenterol. 2004,15:2087-90,.,应用微生态调节剂，可通过有效调节肠道微生态，降低肝病内毒素血症，有效改善肝脏功能,内科学（传染病）国家重点学科 传染病诊治国家重点实验室,肠道微生态变化与肝衰竭模式图,内科学（传染病）国家重点学科 传染病诊治国家重点实验室,肝衰竭代谢组学研究以寻找 肝衰竭发生发展关键物质,肝衰竭发病机制研究进展,内科学（传染病）国家重点学科 传染病诊治国家重点实验室,继基因组学、蛋白质组学后，近年兴起的生命学科主要研究由机体病理生理刺激或遗传变异引起的多参数代谢应答，以及代谢物变化规律,代谢组学,代谢组学、基因组学、蛋白质组与环境之间存在相互作用、相互依存的关系,内科学（传染病）国家重点学科 传染病诊治国家重点实验室,阐明肝衰竭发生发展关键物质,主成分分析（PCA）降维处理,代谢谱分析对分组准确性,样品采集、前处理,质谱检测代谢物,获得大量代谢物数据,起关键作用的代谢标志物分析,肝衰竭代谢组学研究方法,内科学（传染病）国家重点学科 传染病诊治国家重点实验室,建立了GC-MS研究代谢组学的方法,J proteome res. 2007, In press,重型肝炎（肝衰竭）代谢组学研究,对血清样品应用新的衍生化方案进行代谢组学研究，气相色谱质谱（GC-MS）总离子流谱图具有良好的重复性,内科学（传染病）国家重点学科 传染病诊治国家重点实验室,代谢谱主成分分析判断肝衰竭患者病情,病例选择：肝衰竭24例健康对照23例,健康对照组和肝衰竭组经主成分分析，可完全区分开,内科学（传染病）国家重点学科 传染病诊治国家重点实验室,代谢谱与MELD分级进行判别分析，发现代谢谱可判断肝衰竭严重程度，其预测正确率达91.7%,代谢谱与MELD分级比较,重型肝炎肝衰竭血清代谢组学研究为病毒性肝炎严重程度判断标准的完善提供了新的思路,内科学（传染病）国家重点学科 传染病诊治国家重点实验室,慢加急肝衰竭代谢组学研究,研究对象：慢加急肝衰竭37例健康对照50例实验方法：LC-MS研究目的：检测新的判断疾病的标志物，为临床诊断和治疗提供依据,差异代谢物,UPLC-Q-TOF检测两组不同来源分组代谢谱的差异,内科学（传染病）国家重点学科 传染病诊治国家重点实验室,（）健康人（）肝衰竭患者,各项GC-MS检测代谢物谱图：谷胺酰胺、苯丙氨酸等显著升高，乳糖、葡萄糖及三羧酸循环相关代谢物浓度下降，核苷血清水平升高，这些与肝脏损伤直接相关,健康组,肝衰竭组,苯丙氨酸,谷胺酰胺,乙二酸,缬氨酸,甘氨酸,葡萄糖,3-羟基-1,2,3-丙烷三羧酸,1-丙烯-1,2,3-三羧酸,尿素,乳酸,苏氨酸,甘氨酸,L-脯氨酸,L-苏氨酸,半乳糖,丝氨酸,甘油酸,脯氨酸,L-丝氨酸,脯氨酸,核糖,核糖醇,2-脱氧-吡喃型半乳糖,果糖,葡萄糖,松二糖,半乳糖,软脂酸,肌醇,*,*,*,*,*,*,*,*,*,*,*,*,*,*,*,*,* p0.05, * p200万道尔顿的形式存在，利用小孔径血浆分离器的应用减少了肝细胞生长因子的减少小孔径血浆分离器在应用中的另一个优点是：跨膜压非常平稳,*Li LJ, et al. Ther Apher 2005, 9(5):424-429,内科学（传染病）国家重点学科 传染病诊治国家重点实验室,进展血浆透析滤过Plasma Dia-filtration (PDF),将血浆置换与血液透析、血液滤过等结合起来联合应用 清除向血管内移动较慢的物质可设定脱水量，控制体内水分量血浆使用量减少，仅为PE使用量的一半（1600ml）,补充液,内科学（传染病）国家重点学科 传染病诊治国家重点实验室,非生物型ALSS方案组合,内科学（传染病）国家重点学科 传染病诊治国家重点实验室,ALSS治疗取得显著疗效,*Li Lanjuan,et al. Chinese Medical Journal, 2001, 114(9):941-945,肝功能明显改善 P0.001,内毒素显著下降 P0.005,蛋氨酸显著下降 P0.001,BCAA/AAA比值上升P1个月 )和死亡组172 例患者 (存活时间1个月 )方法: 比较两组患者人工肝治疗后72120 h和24 h实验室资料和临床并发症改善程度：结果:实验室资料和临床并发症：24 h : 两组均明显改善(p0.05) 改善程度：无论24h还是72120h, 两组均改善，但死亡组均明显小于存活组 (p0.05), 特别是72120 h. 根据24h、72120h改善程度构建两个logistic 回归模型预测1个月存活率: 72120 h明显优于 24 h (92.4% vs 66.4%).结论:,The curative effect of ALSS on 1-month mortality in AoCLF patients after 72 to 120 hours Int J Artif Organs 2007; 30: 10,人工肝疗效早期评估,Biochemical parameters Improvement post-ALSS at 24 h post-ALSS at 72120 h Survival group Control group Survival group Control groupINR -0.85 4.36 -1.47 2.82 -0.68 1.78 * 0.03 2.67Albumin (g/L) 1.24 6.11 1.34 21.99 2.28 3.28 0.86 15.92Globulin (g/L) -5.11 9.71 -4.35 16.00 -3.86 16.70 -2.04 16.41ALT(U/L) -218.07 803.01 -126.9 334.88 -194.14 802.66 -70.57 365.34AST(U/L) -113.90 188.68 -80.82 434.31 -71.99 375.67 -30.61 169.80CHE (U/L) 2290.26 3227.12 2556.35 3120.39 1996.97 2991.36 1048.98 4699.76Tbil (mol/L) -95.65 117.68 -84.32 133.84 -81.78 233.33 -38.48 140.89TB (mol/L) -331.04 208.93* -252.86 222.30 -277.34 234.17* 23.39 264.56Cre (mol/L) -40.57 7.33* -23.99 13.89 -31.86 46.89* -6.99 13.96Urea (mmol/L) -1.28 1.82 -1.90 9.23 -1.18 4.85 -0.64 1.79(MELD) score -2.32 3.60 -2.27 4.08 -2.21 1.20* 1.02 1.67,AoCLF 患者预后取决于人工肝后72120 h肝性脑病、TB、INR、CRE 改善程度,人工肝治疗后获得新生的病人,内科学（传染病）国家重点学科 传染病诊治国家重点实验室,2000年以来 2002年，中华医学会感染病分会肝衰竭与人工肝学组成立 推出人工肝治疗指南，进一步规范了我国非生物型人工肝的临床治疗,2002年人工肝学组第一次会议,2006年，感染病分会与肝脏病分会联合推出肝衰竭诊疗指南，对肝衰竭的临床诊疗具有重大指导意义,人工肝治疗的标准化和规范化,内科学（传染病）国家重点学科 传染病诊治国家重点实验室,全国非生物型人工肝开展情况（1）,截至2005年，我国大陆所有省市均已开展非生物型人工肝治疗治疗例数：从2000年起至今共治疗例数20662例 治疗效果：重肝治愈好转率高至60%以上,全国人工肝开展单位数情况,内科学（传染病）国家重点学科 传染病诊治国家重点实验室,全国非生物型人工肝开展情况（2）,治疗方法ALSS：14932例 血浆置换：4373例血液滤过：290例活性炭/树脂吸附：71例胆红素吸附：426例MARS ：450例混合人工肝：120例,我国人工肝治疗重型肝炎例数构成,内科学（传染病）国家重点学科 传染病诊治国家重点实验室,生物型人工肝研究进展,内科学（传染病）国家重点学科 传染病诊治国家重点实验室,生物型人工肝,优点清除有毒物质补充活性物质存在问题缺乏代谢功能血浆来源紧张限制应用,优点具有合成、代谢和转化功能关键技术与难点*缺乏理想肝细胞源缺乏高效生物反应器,非生物型人工肝,*Strain AJ,et al.Science,2002,295：1005-9,生物型/混合型人工肝是国内外研究的热点,混合型人工肝,优点：整合两者优势关键技术与难点：二者有机结合的装置及参数等问题,内科学（传染病）国家重点学科 传染病诊治国家重点实验室,生物型/混合型人工肝国外研究现状,国外 生物型/混合型人工肝起步于20世纪80年代后期 迄今有5种生物型/混合型人工肝进入IIII期临床研究 国内 20世纪90年代后期，浙江、重庆、广东、江苏、北京等地相继开展BAL、HAL研究,研究热点：安全、有效的人工肝用肝细胞源高效的生物反应器BAL、HAL系统优化及装置研制,内科学（传染病）国家重点学科 传染病诊治国家重点实验室,常规二步灌流法对大规模分离肝细胞的质量不理想添加Hepes和Dispase等灌流液，进行四步灌流分离肝细胞获满意结果,原代肝细胞分离方法的研究 四步灌流法的建立,Dispase液灌流,含Hepes的平衡盐缓冲液预灌流,EDTA液灌流,胶原酶液灌流,DNase洗涤液洗涤，收集肝细胞悬液,四步灌流法和二步灌流法的流程图,灌流操作图,内科学（传染病）国家重点学科 传染病诊治国家重点实验室,四步灌流法提高了肝细胞活率（96%）、得率（5.3X107/g）和贴壁率（90%）,申请发明专利：生物人工肝用猪和人肝细胞的制备方法(200410084625.7)、用于生产人工肝细胞的试剂(200410084626.1)、 一种肝细胞冻存液（200410089587.4）,新方法为人工肝及细胞生物学研究提供高质量的肝细胞,新鲜分离的肝细胞,培养24h后的肝细胞,内科学（传染病）国家重点学科 传染病诊治国家重点实验室,转染,筛选,正常人肝细胞,生物学功能鉴定,永生化肝细胞克隆,SV40LT-pcDNA3.1(-) 重组载体,建立人源性永生化肝细胞系HepLL,人源性永生化肝细胞系构建研究,传代培养,已稳定传 47 代HepLL具有原代肝细胞相似的生物学特征和功能,HepLL在裸鼠脾内移植，表达肝细胞生物特性,内科学（传染病）国家重点学科 传染病诊治国家重点实验室,在建成HepLL基础上，又建立人源性永生化肝细胞系2株（HepLi2、3）和猪永生化肝细胞系3株（HepLP1、2、3）HepLL系列肝细胞系已被多家研究机构（上海交大、上海肿瘤研究所等）应用于科学研究,人源性永生化肝细胞系为人工肝研究提供了潜在肝细胞源，并为肝细胞移植和体外药物筛选提供新的细胞模型,内科学（传染病）国家重点学科 传染病诊治国家重点实验室,利用经胶原改性的乳酸-乙醇酸共聚物(PLGA)为构建仿生支架进行原代人肝细胞培养PLGA支架可明显促进肝细胞的贴壁和增殖提高肝细胞白蛋白的合成、氨的清除与尿素合成,肝细胞体外组织样培养研究,Li J, Li L, et al.ASAIO J. 2006; 52 (3): 321-7.,内科学（传染病）国家重点学科 传染病诊治国家重点实验室,肝细胞体外大规模培养、冻存研究,可逆性永生化肝细胞,评价肝细胞活性和功能肝细胞形态、超微结构肝细胞数量肝细胞的活率、贴壁率白蛋白合成量细胞色素P450酶活力（安定转化试验）等,新型转瓶培养系统,程序降温、液氮储存,内科学（传染病）国家重点学科 传染病诊治国家重点实验室,微囊化肝细胞的大规模培养,AC(海藻酸钠壳聚糖)微囊包裹HepLL细胞置于转瓶培养仪匀速旋转培养Hep LL细胞随着时间延长，集聚成球，逐渐增多增大,微囊化肝细胞制作,微囊化肝细胞转瓶培养,微囊化HepLL细胞核仁明显，富含线粒体、内质网及糖原颗粒，可见紧密连接及毛细胆管样结构,毛细胆管样结构,细胞间紧密连接,B,富含内质网、线粒体,内科学（传染病）国家重点学科 传染病诊治国家重点实验室,生物反应器研究,理想生物反应器膜或支架材料等具有良好的生物相容性，便于肝细胞黏附、聚集良好的物质交换效能易于“放大”，能够容纳至少1010个肝细胞,肝细胞与患者血浆（血液）进行物质交换的场所,生物复合材料已经成为生物反应器研究的热点之一,生物人工肝系统构成示意图,内科学（传染病）国家重点学科 传染病诊治国家重点实验室,微囊化肝细胞悬浮培养反应器体外评价,微囊化肝细胞悬浮培养反应器,微囊化肝细胞悬浮培养生物反应器：（正在进行体外评价）,生物支架式生物反应器PLGA支架、PLGA/CS支架正在研究中（浙大高分子材化系合作）,生物支架式反应器,内科学（传染病）国家重点学科 传染病诊治国家重点实验室,生物型人工肝动物实验研究,国家自然科学基金面上项目（编号：30270369）资助,建立猪急性肝衰竭动物模型进行生物型人工肝疗效和安全性评价研究,猪肝组织呈现出血性坏死,急性肝衰竭猪动物模型,两只猪正在接受BAL治疗,内科学（传染病）国家重点学科 传染病诊治国家重点实验室,生物型人工肝能有效地改善肝衰竭猪肝功能 生物型人工肝延长肝衰竭猪存活时间急性肝衰竭模型组：487h装置对照组：438h人工肝治疗组：10623h,Li LJ, et al. Journal of Hepatology, 2006,24:317-324Li LJ, et al. International Journal of Artificial Organs, 2003 ,26:507-513专利一种杂合型人工肝装置（ZL03255510.5）,受试动物生存曲线,* 与AHF组、Sham BAL组比较，P 0.01,* 与AHF组、Sham BAL组比较，P 0.05,* 与AHF组、Sham BAL组比较，P 0.01,* 与Sham BAL组比较，P 0.05,内科学（传染病）国家重点学科 传染病诊治国家重点实验室,（三）人工肝支持系统联合肝移植救治晚期重型肝炎,术前人工肝应用能使患者更易耐受手术有效改善一般情况及内环境紊乱 降低ALT和胆红素暂时替代肝脏功能以待择期肝移植术后人工肝应用原发性移植肝无功能