病毒与噬菌体

第二章 病毒与噬菌体,病 毒,一、概述二、病毒的形态结构和化学组分三、四类病毒及其繁殖方式,一、概述,病毒是一类由核酸和蛋白质等少数几种成分组成的超显微“非细胞型生物”，其本质是一种只含DNA或RNA的遗传因子，能以感染态和非感染态两种状态存在。 病毒(virus)，拉丁语的原意是“毒素”。 病毒和病毒颗粒、病毒粒、病毒体(virijon)是其同义词。,（一）人类对病毒的发现和认识过程,1892：俄国 伊万诺夫斯基首次发现烟草花叶病毒的感染因子能通过细菌过滤器。1898：荷兰 贝哲林克证实该致病因子可以被乙醇从悬液中沉淀下来而不失去其感染性但用培养细菌的方法培养不出来；给这样的病原体起名叫virus。1935：美国 斯坛莱从烟草花叶病病叶中提取出了病毒结晶，又证实了结晶中含核酸和蛋白质两种成分，而只有核酸具感染和复制能力。1952：Hershey和Chase证实噬菌体的遗传物质仅仅是DNA,开创了病毒分子生物学。1971后：陆续发现了各种亚病毒类病毒、朊病毒、拟病毒。,1、形态极其微小,必须在电镜下观察,一般具过滤性; 2、没有细胞构造,其主要成分仅是核酸和蛋白质两种，故称分子生物; 3、每一种病毒只含一种核酸,不是DNA就是RNA; 4、既无产能酶系,也无蛋白质和核酸酶合成系统，只能活细胞内专性寄生，5、靠其宿主代谢系统的协助来复制核酸、合成蛋白质等组分，然后再进行装配而得以增殖，形成子代； 6、在离体条件下,能以无生命的化学大分子状态存在,并可长期保持其侵染活力; 7、对一般抗生素不敏感,但对干扰素敏感。8、有些病毒的核酸还能整合到宿主的基因组中，并诱发潜伏性感染。,（二）病毒特征,（三）宿主范围（分布）及重要性,病毒在自然界分布广、数量多。几乎可以感染所有的生物，包括各类微生物、植物、昆虫、鱼类、禽类、哺乳动物和人类。根据宿主可以分为： 动物病毒 植物病毒 细菌病毒（或称噬菌体）等,电子显微镜法(利用负染法),分级过滤法,超速离心沉降法,电泳法,X射线晶体衍射,（四）研究方法,1、病毒大小不同可采用不同的方法进行研究,2、病毒(virus) 、病毒提纯的方法,离心、沉淀、吸附、酶处理、抗血清处理、有机溶剂提取以及电泳、层析等等。,二、病毒（virus）的形态构造和化学成分,（一）病毒大小,（二）病毒的形态构造,（三）化学组成,病毒粒子(virus particle) ：指成熟的、结构完整的、有感染性的病毒个体。在电子显微镜下呈特定的形态。,（一）病毒大小,测定病毒大小的单位是纳米（109)，多数病毒的直径在100nm以下: 150nm 大型病毒（最大300 nm）绝大多数病毒是能通过细菌滤器,须用电镜才能观察到其具体形态和大小。,病 毒 大 小,牛痘苗病毒,传染性浓泡皮炎病毒,腮腺炎病毒,T偶数病毒,疱疹病毒,大蚊病毒,流感病毒,烟草花叶病毒,腺病毒,多瘤病毒,脊髓灰质炎病毒,1微米,（二）病毒的形态,多数病毒呈球形或近似球形，杆状，丝状，少数可为子弹状、砖块状，噬菌体可呈蝌蚪状。,1、病毒粒子的基本结构,衣壳,核心,包膜,刺突,核衣壳,衣壳粒,病毒粒子结构模式图A 结构简单的病毒粒子；B 结构复杂的病毒粒子,2、病毒的对称体制,三类典型形态的病毒：廿面体对称的结构(球状) 螺旋对称的结构(杆状) 复合对称的结构(蝌蚪状)大肠杆菌的T偶数噬菌体是由椭圆形的二十面体头部和螺旋对称的尾部组合而成，是病毒中复合对称的代表。,螺旋对称,二十面体对称,复合对称,(A) Filamentous(B) Complex(C) Eicosahedral(D) Enveloped,RNA or DNA,Protein Coat(Capsomers),Lipid envelope,病毒粒子的对称体制,3、三类典型形态的病毒及其代表,二十面体对称的代表-腺病毒,复合对称的代表-T偶数噬菌体,螺旋对称的代表-烟草花叶病毒(TMV),（1）螺旋对称的代表-烟草花叶病毒 (tobaco mosaicvirus,TMV),有三种类型：纤维状、直杆状和弯曲杆状。衣壳形似一中空柱，内包核酸，衣壳粒和核酸呈螺旋对称形排列。由95衣壳Pr和5SSRNA组成。蛋白质衣壳由衣壳粒（2130个）一个紧挨一个地呈螺旋排列而成，ssRNA位于衣壳内侧螺旋状沟中。,（2）二十面体对称的代表腺病毒(Adenovirus),具有20个面，30条边和12个顶角。核衣壳由不同数量的衣壳粒按一定方式排列成对称体。腺病毒粒子共由252个球形的衣壳粒排列成一个具有廿面的对称体，线状dsDNA。噬菌体 X174只有12个衣壳粒，最大的廿面体是由1，472个衣壳粒组成的昆虫病毒粒子。,绝大多数噬菌体为蝌蚪形，现以E.coli T4为例，介绍蝌蚪形噬菌体的结构：,大肠杆菌T4噬菌体构造,（3）复合对称的代表T偶数噬菌体,95nm,95nm,65nm,24环,颈环,3、病毒的群体形态,包涵体(inclusion body),噬菌斑(plaque),空斑(plaque),枯斑(lesion),病毒的群体形态有：,（1）包涵体（inclusion body）,概念：感染病毒的宿主细胞内，出现在光学显微镜下可见的大小、形态、数量不等的小体，称为包涵体。在宿主细胞内形成包涵体是病毒的特征，不同的病毒其形成的包涵体具有不同的形态、结构和特性。,包涵体在细胞中的形成部位： 位于细胞核内如包疹病毒 位于细胞质内如狂犬病毒等 胞核内胞质都有麻疹病毒,包涵体（inclusion body）,是病毒的聚集体;,是病毒的合成部位;,是病毒蛋白和与病毒感染有关的蛋白质,非病毒性包涵体,由化学因子或细菌感染形成,包涵体的实践意义-病毒鉴定、临床诊断依据。,(2)噬菌斑(plaque),噬菌斑是指在宿主细菌的菌苔上，噬菌体使菌体裂解而形成的空斑。,应用：1、噬菌体定量计数2、噬菌体的鉴定,空斑和病斑,在动物细胞培养物上的与噬菌斑类似的空斑,称为病斑.因为受肿瘤病毒感染。 空斑和病斑用于动物病毒粒子的计数也可以采用噬菌斑法类似的技术。,枯斑：植物病毒在植物叶片上形成的群体 称为枯斑。,（三）化学组成,病毒的主要成分为核酸（DNA或RNA）和蛋白质。有的病毒还含有脂质、糖类等其他组分。,1、病毒的核酸,病毒核酸是病毒粒中最重要的成分，是病毒繁殖、遗传变异与感染性的物质基础。核酸构成了病毒的基因组。病毒核酸的种类很多，是病毒分类鉴定中的重要指标： 是DNA还是RNA；是单链还是双链； 呈线状还是环状； 是闭环还是开口环； 基因组是单分子、双分子、三分子或多分子； 核酸的碱基或碱基对数；核苷酸序列等。,一种病毒至少含有一种核酸（DNA或RNA）。 植物病毒绝大多数含DNA;少数含RNA； 动物病毒一部分含DNA，一部分含RNA； 细菌病毒普遍含DNA，含RNA的极少。病毒的核酸类型极为多样化： 病毒的DNA与RNA均有单链和双链： dsDNA ssDNA dsRNA ssRNA,病毒核酸的种类,病毒DNA分子有线状和环状之分。,有的病毒只有一种蛋白质，多数含有为数不多的几种蛋白质。病毒蛋白质的氨基酸组成与其他生物一样，但不同病毒蛋白质的氨基酸组成和含量各不相同。病毒蛋白质主要在构成病毒结构、病毒的侵染与增殖过程中发挥作用。,3.其他成分,一些较复杂的病毒（如包膜病毒）除含有核酸和蛋白质两种成分外，还含有脂类、多糖等其他成分。,2.病毒的蛋白质,三、各类病毒及其繁殖方式,原核生物病毒噬菌体,植物病毒,人类和脊椎动物病毒,昆虫病毒,(一)原核生物的病毒噬菌体,噬菌体：是病毒中的一种，一般把侵染细菌、放线菌、蓝细菌的病毒叫噬菌体，包括噬细菌体、噬放线菌体、噬蓝细菌体等。 把侵染真菌的病毒叫噬真菌体。噬菌体在自然界广泛存在，在1995年发表的ICTV的病毒分类与命名第六次报告中共报道了4000余种，分别划归为49个病毒科。噬菌体共有六类形态。,噬菌体的六类形态：,T-系噬菌体T-系噬菌体是研究的最广泛而又深入的细菌噬菌体，按发现的先后顺序进行从T1-T7编号，后来发现其中偶数者的形态都相同（蝌蚪形收缩性长尾），故统称T偶数噬菌体。,噬菌体的类型,温和噬菌体（temperate phrage）噬菌体感染细胞后，将其核酸整合（插入）到宿主的核DNA上，并且可以随宿主DNA的复制而进行同步复制，在一般情况下，不引起寄主细胞裂解的噬菌体。,烈性噬菌体（virulent phage）感染细胞后,能在寄主细胞内增殖，产生大量子代噬菌体并引起细菌裂解的噬菌体。,噬菌体的繁殖分为：吸附、侵入、增殖（复制与生物合成）、成熟（装配）和裂解（释放）5个阶段。,（1）噬菌体的繁殖,裂解性周期（增殖性周期）：烈性噬菌体的繁殖过程。, 吸附(adsorption),噬菌体对宿主细胞的吸附具高度的特异性。,吸附的机理：尾丝尖端与受体发生共价结合。,影响吸附的因素：噬菌体数量；阳离子浓度；温度；辅助因子（生物素）等。,自外裂解：大量噬菌体吸附在同一细胞表面并释放众多的溶菌酶，最终因外在的原因导致细胞裂解。, 侵入(penetration),头部的核酸通过中空的尾髓压入细胞内，而蛋白质外壳则留在细胞外。尾鞘的收缩性可明显提高噬菌体核酸注入的速率。, 增殖 (replication),包括核酸的复制和蛋白质的生物合成。增殖是通过噬菌体基因表达实现的。核酸的复制与病毒蛋白质的合成是分开进行的。,病毒核酸链接入寄主核酸链 病毒核酸复制,病毒核酸的复制, 成熟（装配）,已合成的各部件进行自行装配成新的噬菌体的过程。,T偶数噬菌体装配过程模式图,被感染细胞裂解，成熟的子代噬菌体转移到外界。开始新的生活史。, 裂解（释放）,裂解量：平均每一宿主细胞裂解后所产生的 子代噬菌体数。,有囊膜病毒以“出芽”方式释放,2、噬菌体效价的测定,效价（噬菌斑形成单位数、感染中心数）：每ml样品中所含有的具侵染性的噬菌体粒子数。,测定方法： 斑点试验法、液体稀释管法、单层平板法、 双层平板法、快速玻片法,噬菌斑数=试样中噬菌体数,双层平板法,（1）一步生长曲线的基本实验步骤,离 心 术,抗病毒血清,培养,定时取样测噬菌斑数,以培养时间为横坐标，以噬菌斑数为纵坐标，绘出的曲线为一步生长曲线。,3、噬菌体增殖规律的描述方法一步生长曲线,定量描述烈性噬菌体生长规律的实验曲线。,（2）一步生长曲线的三个阶段:,潜伏期、裂解期、平稳期 1）潜伏期 噬菌体的核酸侵入宿主细胞至第一个成熟噬菌体粒子装配前的一段时间。可分为两个阶段：隐晦期、胞内累积期。2）裂解期 紧接在潜伏期后的宿主细胞迅速裂解、溶液中噬菌体粒子急剧增多的一段时间。3）平稳期 感染后的宿主细胞已全部裂解，溶液中噬菌体效价达到最高点的时期。,温和噬菌体特点,游离态温和整合态(原噬菌体）营养态,具有整合能力；,具有同步复制能力；,都是dsDNA;,4、溶源性,溶源性：温和噬菌体侵入宿主细菌细胞后，由于其核酸整合到宿主核基因组上，并随宿主核酸同步复制，并不引起宿主细胞裂解的特性。子代均具有溶源性。,温和噬菌体存在形式,溶源性与溶源性细菌,溶源性细菌：含有原噬菌体的细菌称为溶源性细菌（lysogenic bacteria）或溶源化细胞(lysogeniccell)。溶源菌是一类能和温和噬菌体长期共存，一般不会出现有害影响的细胞。溶源性（溶源现象）：是温和噬菌体侵入宿主细菌细胞后，由于其核酸整合到宿主核基因组上，并随宿主核酸同步复制，并不引起宿主细胞裂解的特性。凡能引起溶源性的噬菌体即为温和噬菌体。,溶源性广泛存在于各种细菌中，如大肠杆菌、假单胞菌、沙门氏菌、链球菌、芽孢杆菌、棒杆菌、弧菌和极毛杆菌等。溶源性菌株命名：在敏感菌株的名称后面加一括号，其中写上溶源性噬菌体，例如E.coliK12()。,溶源性细菌的测定,1）将少量溶源菌与大量敏感性的指示菌相混合；2）与琼脂培养基混匀后倒平板；3）经培养后溶源菌长出如图菌落。,噬菌体的应用,噬菌体会给人类造成损失，利用微生物进行发酵的工业常深受其害。但是，由于噬菌体的某些生物学特性，使其在人类的生产实践和生物学基础理论研究中都有一定价值。可概括为以下几方面。,1)用于鉴定未知细菌 在医学上，有些难鉴别的病原菌，利用噬菌体对宿主细胞的高度专化性的敏感性，不仅可鉴定到菌种，而且可鉴定到菌型。2)用于临床 治疗某些传染性疾病。 如果将噬菌体制剂与抗生素或者磺胺药物配合应用，则效果更好。3)检验植物病原菌 利用噬菌体可以检验由种子携带的植物病原菌。4)测定辐射剂量 某些噬菌体(如T2)对辐射剂量的反应敏感而精确。5)噬菌体在分子生物学研究中的作用 噬菌体现已成为进行分子生物学研究的较为理想的重要材料。,（二）植物病毒,已知的植物病毒多达700种（1989年），多数是ssRNA病毒。形态：杆、丝、球状，一般无包膜。,1619年荷兰画师描画的有病郁金香的画像。,花叶、黄化或红化等症状,植株发生矮化，丛枝或畸形等,形成枯斑或坏死等症状,植物黄萎病,植物感染病毒后的主要症状,借昆虫刺吸式口器进入、通过伤口或嫁接进入 ，再通过胞间连丝或输导组织迅速向其它部位扩散引起普遍感染。,1、“侵入”方式,3、核酸的复制和蛋白质的合成,2、脱壳植物病毒侵入宿主细胞后才能发生脱壳。,增殖过程,4、装配（成熟）,（三）人类和脊椎动物病毒,在人类与脊椎动物中广泛寄生着相应的病毒。人类传染病80由病毒引起（300种），脊椎动物病毒900种，许多病毒引起人畜共患