《分子物理学》PPT课件.ppt

定量生理学 李光大河南科技大学医学技术与工程学院 MolecularBiophysics 第二章分子生物物理学 阐明生命现象 第二章分子生物物理学 第一节生物大分子的结构与功能第二节测定生物大分子结构的物理方法 前言一 在我们居住的地球 有大约1000万种生物 从高山到平原 从沙膜到极地 从空中到海洋 几乎到处都有生命的踪迹 有天上飞的 地下爬的 水中游的 有的生物只是一个单细胞 如大肠杆菌和酵母菌 有的则有复杂的组织和器官 象人体就有1014体细胞 二 如果就生物大分子而言 人体大约有50000种以上的蛋白质 同时含有数以万计的核酸及其它大分子种类 地球上的全部生物 估计包括1011种蛋白和差不多相同数量的核酸 即使极为简单的大肠杆菌 其体积约为2 10 12cm3 也含有3000多种蛋白质 1000多种核酸 还有1000多种其他生物大分子和低分子的有机化合物 生物大分子是生物大分子是一切生命形式的基础切生命形式的基础 三 在这样种类复杂 形态万千的生物体系中 人们必须寻求生命状态的基本逻辑原理 这就是 一 生物大分子虽然具有复杂的结构 但在组成方面却存在一种基本的简单性 例如 1 DNA由4种脱氧核糖核苷酸 4dNTP 聚合而成 2 RNA由4种核糖核苷酸 4NTP 聚合而成 3 蛋白质由20余种氨基酸聚合而成 4 多糖由少数几种单糖聚合而成 二 所有的生物都使用相同种类的的构件分子 似乎它们是从一个共同的祖先进化而来 三 每种生物的特性是通过它具有的一套与众不同的核酸和蛋白质而保持的 四 每种生物大分子在细胞中有特定的功能 四 生物大分子 biopolymer biomacromolecule 是指生物体内由分子量较低的基本结构单位首尾相连形成的多聚化合物 包括核酸 蛋白质和多糖 基本结构单位的排列顺序构成生物大分子的一级结构 生物大分子在其一级结构的基础上形成复杂的空间结构 自然界典型的生物大分子的分子量在10 103 之间 五 基因组研究 基因表达调控研究 结构分子生物学研究和信号传导研究是当今分子生物学研究的4大前沿领域 生物功能由结构所决定 生物大分子在表现其生理功能过程中 必须具备特定的空间立体结构 即三维结构 现已知道 在DNA 基因或RNA水平 存在各种体现功能结构域 结构域本身特点和形态及它们所处的空间大分子的空间结构形态都直接影响DNA 基因或RNA的功能发挥 在蛋白质水平由于它们是直接体现生物理功能的物质 其空间结构对其功能影响更为直接 因此 蛋白质的空间结构与功能的关系研究是结构分子生物学研究的主体 六 研究生物大分子结构的新技术 新方法和新仪器不断改进和涌现 如 DNA重组技术酶逐步降解技术基因自动合成和测序技术X线晶体学分析技术计算机技术以及不同技术组合 使获得 清晰度的结构图象 了解生物过程中蛋白质构象的动态变化 以及对生物大分子结构进行贮存 比较和结构 功能预测成为可能 七 生物大分子空间结构的阐明对某些相关疾病发生机理的研究及设计诊断 治疗和预防方案具有重要意义 特别是对新药的分子设计与模拟 具有实际应用的指导意义 它可以把基础研究与应用 开发结合起来 第一节生物大分子的结构与功能 蛋白质 protein 是由许多氨基酸 aminoacids 通过肽键 peptidebond 相连形成的高分子含氮化合物 一蛋白质的生物学重要性 1 蛋白质是生物体的重要组成成分分布广 所有器官 组织都含有蛋白质 细胞的各个部分都含有蛋白质 含量高 蛋白质是细胞内最丰富的有机分子 占人体干重的45 某些组织含量更高 例如脾 肺及横纹肌等高达80 一蛋白质的生物学重要性 2 蛋白质具有重要的生物学功能1 作为生物催化剂2 代谢调节作用3 免疫保护作用4 物质的转运和存储5 运动与支持作用6 参与细胞间信息传递 二蛋白质的分子组成TheMolecularComponentofProtein 蛋白质的元素组成 主要有C H O N和S 有些蛋白质含有少量P或金属元素Fe Cu Zn Mn Co Mo 个别蛋白质还含有I 蛋白质的含氮量平均为16 通过样品含氮量计算蛋白质含量的公式 蛋白质含量 g 含氮量 g 6 25 蛋白质元素组成的特点 1 氨基酸 蛋白质的基本组成单位 存在自然界中的氨基酸有300余种 但组成人体蛋白质的氨基酸仅有20种 且均属L 氨基酸 甘氨酸除外 蛋白质的基本单位 L 氨基酸 或 L 氨基酸的结构通式 投影式 与羧基相邻的 碳原子上都有一个氨基 因而称为 氨基酸 非极性疏水性氨基酸极性中性氨基酸酸性氨基酸碱性氨基酸 1 氨基酸的分类 习惯分类方法芳香族氨基酸 Trp Tyr Phe含羟基氨基酸 Ser Thr Tyr含硫氨基酸 Cys Met杂环族氨基酸 His杂环族亚氨基酸 Pro支链氨基酸 Val Leu Ile 2 氨基酸的理化性质 两性解离及等电点 紫外吸收 茚三酮反应 2 肽 肽键 peptidebond 是由一个氨基酸的 羧基与另一个氨基酸的 氨基脱水缩合而形成的化学键 1 肽 peptide 多肽链 polypeptidechain 二肽 三肽 寡肽 oligopeptide 多肽 polypeptide 氨基酸残基 residue 氨基末端 aminoterminal 和羧基末端 carboxylterminal 主链和侧链 多肽链 2 几种生物活性肽 a 谷胱甘肽 glutathione GSH 结构 谷氨酸 半胱氨酸和甘氨酸组成的三肽谷氨酸的 羧基形成肽键 SH为活性基团为酸性肽是体内重要的还原剂 肽类激素 如促甲状腺素释放激素 TRH 神经肽 neuropeptide b 肽类激素及神经肽 多肽与蛋白质 蛋白质与多肽并无严格的界线 通常是将分子量在6000道尔顿以上的多肽称为蛋白质 蛋白质分子量变化范围很大 从大约6000到1000000道尔顿甚至更大 3蛋白质的分类 根据蛋白质组成成分 根据蛋白质形状 三蛋白质的分子结构TheMolecularStructureofProtein 蛋白质的分子结构包括 一级结构 primarystructure 二级结构 secondarystructure 三级结构 tertiarystructure 四级结构 quaternarystructure 一级结构二级结构三级结构四级结构 定义 蛋白质的一级结构指多肽链中氨基酸的排列顺序 一 蛋白质的一级结构 主要化学键 肽键二硫键的位置属于一级结构研究范畴 一级结构是蛋白质空间构象和特异生物学功能的基础 从肽链的一级结构可以预测蛋白质的二级结构 在这个基础上三级结构的预测 有相当的难度 胰岛素的一级结构 30 21 二 蛋白质的二级结构 蛋白质分子中某一段肽链的局部空间结构 即该段肽链主链骨架原子的相对空间位置 并不涉及氨基酸残基侧链的构象 定义 稳定因素 氢键 一 肽单元 peptideunit 参与组成肽键的6个原子 C 1 C O N H C 2 位于同一平面 又叫酰胺平面或肽键平面 它是蛋白质构象的基本结构单位 肽单元 H H H H 蛋白质二级结构的主要形式 螺旋 helix 折叠 pleatedsheet 转角 turn 无规卷曲 randomcoil 二 螺旋 结构要点 多肽链主链围绕中心轴形成右手螺旋 侧链伸向螺旋外侧 每圈螺旋含3 6个氨基酸 螺距为0 54nm 每个肽键的亚氨氢和第四个肽键的羰基氧形成的氢键保持螺旋稳定 氢键与螺旋长轴基本平行 螺旋坚实有弹性 三 折叠 多肽链充分伸展 相邻肽单元之间折叠成锯齿状结构 侧链位于锯齿结构的上下方 两段以上的 折叠结构平行排列 两链间可顺向平行 也可反向平行 两链间的肽键之间形成氢键 以稳固 折叠结构 氢键与螺旋长轴垂直 折叠有一定强度 缺乏延伸性 四 转角和无规卷曲 转角 无规卷曲 没有确定规律性的肽链结构 肽链内形成180 回折 含4个氨基酸残基 第一个氨基酸残基与第四个形成氢键 第二个氨基酸残基常为Pro 转角 五 模体 蛋白质分子中 二个或三个具有二级结构的肽段 在空间上相互接近 形成一个具有特殊功能的空间构象 被称为模体 motif 螺旋 环 螺旋 锌指 六 影响二级结构形成的因素 氨基酸侧链所带电荷 大小及形状 影响 螺旋形成的因素 折叠形成条件 要求氨基酸侧链较小 三 蛋白质的三级结构 疏水键 离子键 氢键和VanderWaals力等 稳定因素 整条肽链中全部氨基酸残基的相对空间位置 即肽链中所有原子在三维空间的排布位置 定义 1963年Kendrew等通过鲸肌红蛋白的x 射线衍射分析 测得了它的空间结构 肌红蛋白 Mb Mb是一个只有三级结构的单链蛋白质 有8段 螺旋结构 整条多肽链折叠成紧密球形分子 氨基酸侧链上的疏水侧链大都在分子内部 富极性及电荷的则在分子表面 Mb分子内部有一个袋形空穴 血红素居与其中 血红素辅基与蛋白质部分稳定结合 纤连蛋白分子的结构域 结构域 domain 大分子蛋白质的三级结构常可分割成一个或数个球状或纤维状的区域 折叠得较为紧密 各行其功能 称为结构域 生理意义 常常是活性中心和变构中心所在处 结构域 Triosephosphateisomerase磷酸丙糖异构酶 结构域在蛋白质中起着独立的结构单位 功能单位与折叠单位的作用 在复杂蛋白质中 结构域具有结构与功能组件与遗传单位的作用 模体 motif 即超二级结构 简言之 就是二级结构有规律的组合 例如螺旋 环 螺旋 贝塔折叠的组合 阿而法螺旋组合等 再比如亮氨酸拉链 锌指结构都是典型的模体构域 它们执行一定的功能 即模体既是结构的单位 又是功能单位 他们可直接作为结构域和三级结构的建筑块 某些蛋白质因子与DNA大沟结合的部位靠的就是某些特异的模体 结构域 domain 是指在较大的蛋白质分子中形成的某些在空间上可以辨别的结构 往往是球状压缩区或纤维状压缩区 它们也既是结构单位 又是功能单位 例如免疫球蛋白的功能区就是结构域 四 蛋白质的四级结构 对蛋白质分子的二 三级结构而言 只涉及一条多肽链卷曲而成的蛋白质 而有些蛋白质分子含有二条或多条多肽链 其中每一个具有独立三级结构的多肽链称为蛋白质的亚基 蛋白质分子中各亚基之间的相对空间位置 称为蛋白质的四级结构 由一条肽链形成的蛋白质没有四级结构 主要的化学键主要是疏水键 氢键和离子键 血红蛋白的四级结构 血红蛋白 具有 个亚基组成的四级结构 可结合 分子氧 成人由两条 肽链和两条 肽链组成 一级结构二级结构三级结构四级结构 蛋白质结构与功能的关系TheRelationofStructureandFunctionofProtein 一 一级结构是空间构象的基础 一 蛋白质一级结构与功能的关系 一级结构相似的蛋白质 其基本构象及功能也相似 例如 不同种属的生物体分离出来的同一功能的蛋白质 其一级结构只有极少的差别 而且在系统发生上进化位置相距愈近的差异愈小 物种越接近 其同类蛋白质一级结构越相似 功能也相似 细胞色素C分子中氨基酸残基的差异数目及分歧时间 天然状态 有催化活性 尿素 巯基乙醇 去除尿素 巯基乙醇 非折叠状态 无活性 一级结构是空间构象和功能的基础 空间构象遭破坏的多肽链只要其肽键未断 一级结构未被破坏 就能恢复到原来的三级结构 功能依然存在 二 一级结构与功能的关系 例 镰刀形红细胞贫血 一级结构中有些氨基酸的作用却是非常重要的 若蛋白质分子中起关键作用的氨基酸残基缺失或被替代 都会严重影响其空间构象或生理功能 产生某种疾病 这种由蛋白质分子发生变异所导致的疾病 称为 分子病 镰刀状贫血病 血液中大量出现镰刀红细胞 患者因此缺氧窒息 正常细胞镰刀形细胞 它是最早认识的一种分子病死亡率极高由于遗传基因突变导致血红蛋白分子结构突变 二 蛋白质空间结构与功能的关系 蛋白质多种多样的功能与各种蛋白质特定的空间构象密切相关 蛋白质的空间构象是其功能活性的基础 构象发生变化 其功能活性也随之改变 蛋白质变性时 由于其空间构象被破坏 故引起功能活性丧失 变性蛋白质在复性后 构象复原 活性即能恢复 二 蛋白质空间结构与功能的关系 除受物理 化学因素而引起的构象破坏所致的活性丧失之外 在正常情况下 有很多蛋白质的天然构象也不是固定不变的 人体内有很多蛋白质往往存在着不只一种天然构象 但只有一种构象能显示出正常的功能活性 因而 常可通过调节构象的变化来影响蛋白质 或酶 的活性 从而调控物质代谢反应或相应的生理功能 二 蛋白质空间结构与功能的关系 当某种小分子物质特异地与某种蛋白质 或酶 结合后 结合部位多在远离活性部位的另一部位 通常称为别位 能够引起该蛋白质 或酶 的构象发生微妙而规律的变化 从而使其活性发生变化 活性可以从无到有或从有到无 也可以从低到高或从高到低 这种现象称为别构效应 allostericeffect 也有人译为别位效应或变构效应 具有这种特性的蛋白质或酶称为别构蛋白质或别构酶 凡能和别构蛋白质或别构酶结合并引起此种效应的小分子物质 被称为别构效应剂 别构效应充分说明了构象与功能活性之间的密切关系 一 肌红蛋白与血红蛋白的结构 二 蛋白质空间结构与功能的关系 肌红蛋白和血红蛋白是两个研究得最透彻的蛋白质 它们是蛋白质结构与功能的范例 肌红蛋白是哺乳动物肌肉中储氧的蛋白质 它和血红蛋白的亚基在氨基酸序列上具有明显的同源性 它们的构象和功能也十分相似 肌红蛋白 Mb是一个只有三级结构的单链蛋白质 有8段 螺旋结构 易与氧气结合 氧解离曲线呈直角双曲线 整条多肽链折叠成紧密球形分子 氨基酸侧链上的疏水侧链大都在分子内部 富极性及电荷的则在分子表面 Mb分子内部有一个袋形空穴 血红素居与其中 血红素辅基与蛋白质部分稳定结合 血红蛋白 血红蛋白具有4个亚基组成的四级结构 每个亚基中间有一个疏水袋形空穴 可结合一个血红素并携带1分子氧 因此1分子Hb共结合4分子氧 Hb各亚基的三级结构与Mb极为相似 Hb各亚基之间通过8对盐健 紧密结合成亲水的球状蛋白 成人红细胞中Hb主要是由两条 肽链和两条 肽链组成 2 2 氧结合引起的Hb的构象变化变构脱氧血红蛋白氧合血红蛋白对氧的亲和力低对氧的亲和力高氧合作用改变Hb四级结构 Hb的两种不同构象态 tensestate relaxedstate 在肺部毛细血管内 O2分压很高 促使T型转变为R型 利于Hb饱和地 装载 O2 在全身组织毛细血管中 O2分压较低 R型Hb又转变为T型 有利于释放O2 Hb分子两型构象的互变 引起结合O2与释放O2的变化 这就微妙地完成了运O2的功能 三 蛋白质构象改变与疾病 蛋白质构象病 若蛋白质的折叠发生错误 尽管其一级结构不变 但蛋白质的构象发生改变 仍可影响其功能 严重时可导致疾病发生 蛋白质构象病的机理 有些蛋白质错误折叠后相互聚集 常形成抗蛋白水解酶的淀粉样纤维沉淀 产生毒性而致病 表现为蛋白质淀粉样纤维沉淀的病理改变 这类疾病包括 人纹状体脊髓变性病 老年痴呆症 亨停顿舞蹈病 疯牛病等 疯牛病疯牛病是由朊病毒蛋白 prionprotein PrP 引起的一组人和动物神经退行性病变 正常的PrP富含 螺旋 称为PrPc PrPc在某种未知蛋白质的作用下可转变成全为 折叠的PrPsc 从而致病 PrPc 螺旋 PrPsc 折叠 正常 疯牛病 第二节测定生物大分子结构的物理方法 生物大分子的形态结构测定物理方法 荧光显微镜透视电镜扫描电镜扫描隧道显微镜原子力显微镜核磁共振X 射线晶体衍射 光学显微镜 第一代为光学显微镜 1830年代后期为M Schleide和T Schmann所发明 它使人类 看 到了致病的细菌 微生物和微米级的微小物体 对社会的发展起了巨大的促进作用 至今仍是主要的显微工具 第二代为电子显微镜 20世纪三十年代早期卢斯卡 E Ruska 发明了电子显微镜 使人类能 看 到病毒等亚微米的物体 它与光学显微镜一起成了微电子技术的基本工具 第三代为扫描探针显微镜 也可简称为纳米显微镜 1981年比尼格和罗勒发明了扫描隧道显微镜 STM 使人类实现了观察单个原子的原望 1985年比尼格应奎特 C F Quate 发明了可适用于非导电样品的原子力显微镜 AFM 也具有原子分辨率 与扫描隧道显微镜一起构建了扫描探针显微镜 SPM 系列 三种观察原子的方法比较 三代显微镜的观察范围及典型物体 原理 主要由物镜和目镜组成 物镜的焦距很短 目镜焦距长 物镜作用是得到物体放大的实象 目镜是将物镜所成实象作为物体得到放大的虚象 物体到物镜L1距离稍大于物镜焦距F1 通过物镜得到放大的实象 位于目镜的焦距F2以内 是目镜的物体 通过目镜得到放大虚象 显微镜光学原理 显微镜光路示意图 显微镜分辨能力 公式表明 从增大nsin 来提高分辨率是很困难的 最有效的方法是缩短光源的波长 入射光波长n 透射材料的折射率 物镜对像的张角 孔径角 荧光显微镜的基本构造是由普通光学显微镜加上一些附件 如荧光光源 激发滤片 双色束分离器和阻断滤片等 的基础上组成的 荧光显微镜 透射式荧光显微镜光路原理图 荧光显微镜的优点和用途 优点 检出能力高对细胞的刺激小能进行多重染色用途 物体构造的观察荧光的有无 色调比较进行物质判别发荧光量的测定对物质定性 定量分析 观察标本中的自发荧光物质或以荧光素染色或标记的细胞和结构 组织中的自发性荧光物质如神经细胞和心肌细胞等内的脂褐素呈棕黄色荧光 肝贮脂细胞和视网膜色素上皮细胞内的维生素A呈绿色荧光 某些神经内分泌细胞和神经纤维内的单胺类物质 儿茶酚胺 5 羟色胺 组胺等 在甲醛作用下呈不同颜色的荧光 组织内含有的奎宁 四环素等药物也呈现一定的荧光 嗜中性粒细胞中脱氢酶辅酶呈现一定的荧光 什么是荧光 物质中的电子吸收光的能量由低能状态转变为高能状态 再回到低能状态时释放出的光 即 物质吸收短波光 发射出的长波光 一种光化荧光 荧光的种类 自发荧光二次荧光 自发荧光 物质受光激发产生的固有荧光二次荧光 物质借荧光色素受光激发产生的荧光 染色 不染色 激发光 发射光 细胞荧光显微镜照片 微管呈绿色 微丝红色 核蓝色 透射电镜TEM 分辨率 0 61 nsin 式中 入射光波长n 透射材料的折射率 物镜对像的张角 孔径角 公式表明 从增大nsin 来提高分辨率是很困难的 最有效的方法是缩短光源的波长 透射电镜TEM 在真空条件下 电子束经高压加速后 穿透样品时形成散射电子和透射电子 它们在电磁透镜的作用下在荧光屏上成像 电镜所采用的电子波长可按下式计算 可见 只要提高加速电压v就可以得到波长的电子波 分辨率也就相应得到提高 目前TEM的最佳分辨率为1 4 电镜与光镜的比较 热阴极电子枪获得电子束作为照明源 加速电压 50 100KV 高速 聚成很细的电子束 透过样品的电子束强度取决于样品 微区的厚度 平均原子序数 晶体结构或位向 的差别 形成一幅反映样品微观特征的高分辨率电子像 投影到荧光屏上 电子强度分布转换为光强度分布 得到一幅具有一定衬度的高放大倍数的图像 扫描电镜 激光扫描共聚焦显微镜扫描隧道显微镜原子力显微镜 扫描电镜 扫描电镜是用极细的电子束在样品表面扫描 将产生的二次电子用特制的探测器收集 形成电信号运送到显像管 在荧光屏上显示物体 细胞 组织 表面的立体构像 可摄制成照片 疟疾破坏的两个红细胞 SEM的特点是按时间序列取出信号 便于研究样品随时间的变化 信号容易被记录在磁带上并能再现 而且为了提高像的质量 可以从电子线路方面进行图像处理 如果用电子照射样品后所产生的X射线 光 阴极发光 俄歇等信号 则还可以进行表面显微物性研究 因而有广阔的应用范围 和TEM相比 SEM具有景深大 图像富有立体感 成像的放大率范围广 样品制备简单 可动范围大等特点 另外由于样品室的空间较大 样品在其中可用三度空间平移和三度空间旋转 便于观察 电子束的直径小 束的能量也较小 加速电压可以小到2千伏 而且是以非固定的光栅状方式在样品表面扫描 因此由于电子照射而引起的样品损伤和污染很小 在观察相貌的同时 还可以利用样品发出的其它信息在微区上作成分分析和晶体结构分析 但SEM不能显示样品内部的细节 激光共聚焦扫描显微镜 激光共聚焦扫描显微镜 laserconfocalscanningmicroscope 用激光作扫描光源 逐点 逐行 逐面快速扫描成像 扫描的激光与荧光收集共用一个物镜 物镜的焦点即扫描激光的聚焦点 也是瞬时成像的物点 激光束的波长较短 光束很细 所以共焦激光扫描显微镜有较高的分辨力 大约是普通光学显微镜的3倍 激光共聚焦扫描显微镜既可以用于观察细胞形态 也可以用于细胞内生化成分的定量分析 光密度统计以及细胞形态的测量 扫描隧道显微镜 STM 不用任何电子光学系统 仅用一个微小的针尖在离样品10 的地方进行扫描 测定其隧道电流就可得到显微图像 这种在结构上比电镜简单得多 但得到很高的放大率 而且没有像差的设备就叫做扫描隧道显微镜 scanningtunnelingmicroscopySTM 扫描隧道显微镜STM 1982年 IBM瑞士苏黎士实验室的葛 宾尼 G Binning 和海 罗雷尔 H Rohrer 研制出世界上第一台扫描隧道显微镜 ScanningTunnellingMicroscope 简称STM STM使人类第一次能够实时地观察单个原子在物质表面的排列状态和与表面电子行为有关的物化性质 在表面科学 材料科学 生命科学等领域的研究中有着重大的意义和广泛的应用前景 被国际科学界公认为20世纪80年代世界十大科技成就之一 为表彰STM的发明者们对科学研究所作出的杰出贡献 1986年宾尼和罗雷尔被授予诺贝尔物理学奖金 特点 电子显微镜方法固然有其自身的许多优点 但使用时必须要求高真空和外源高压电子束STM的原子级空间分辨率 横向分辨率为0 1nm 由样品表面电流线度决定纵向分辨率优于0 01nm 与噪声有关 即1mV可改变0 01nm关系不使用自由粒子无需有透镜和专门的电子源 辐射源就是存在于待测样品表面的束缚电子 不存在辐照损伤和污染能在大气水溶液等近天然条件下对单个生物大分子进行直接观察 为研究分立的蛋白质与核酸分子的结构提供了强有力的工具 原理 经典物理学认为 样品表面是分明的 发生在表面的反射会限制住电子 因此不存在电子云量子力学认为 电子的行为就象是波 其位置是 弥散 的 这便解释了物质表面也有电子存在的原因在物质表面之外的空间发现电子的几率会随着与表面距离的增大而呈指数式的衰减 这样的电子就象是在表面边界上穿挖隧道而出的 这一效应一般叫做隧道贯穿 电子隧道发射理论 当绝缘层足够薄以致两块金属之外的电子云能够有微小的重叠时 就可以发生隧道效应 又在金属片加上电压时就会有电子的定向流动 这就是隧道电流 两个平板导体间的隧道效应实验装置稍加改变即成为STM的雏形 Z 1nmIT V e K0ZZ 间隔距离V 偏压 隧道电流的变化曲线 Ro与样品表面相关的参数 Z有0 1nm的变化 IT即有数量级的变化 配合扫描隧道谱 STS 可以得到有关表面电子结构的信息 例如表面不同层次的态密度 表面电子阱 电荷密度波 表面势垒的变化和能隙结构等 利用STM针尖 可实现对原子和分子的移动和操纵 这为纳米科技的全面发展奠定了基础 1990年 IBM公司的科学家展示了一项令世人瞠目结舌的成果 他们在金属镍表面用35个惰性气体氙原子组成 IBM 三个英文字母 这是中国科学院化学所的科技人员利用纳米加工技术在石墨表面通过搬迁碳原子而绘制出的世界上最小的中国地图 原子力显微镜 STM的原理是电子的 隧道效应 所以只能测导体和部分半导体1985年 IBM公司的Binning和Stanford大学的Quate研发出了原子力显微镜 AFM 弥补了STM的不足 实物图及原理 随着科学技术的发展 生命科学开始向定量科学方向发展 大部分实验的研究重点已经变成生物大分子 特别是核酸和蛋白质的结构及其相关功能的关系 因为AFM的工作范围很宽 可以在自然状态 空气或者液体 下对生物医学样品直接进行成像 分辨率也很高 因此 AFM已成为研究生物医学样品和生物大分子的重要工具之一 AFM应用主要包括三个方面 生物细胞的表面形态观测 生物大分子的结构及其他性质的观测研究 生物分子之间力谱曲线的观测 1 AFM对生物细胞的表面形态观察2 生物大分子的结构及其他性质的观测研究2 1蛋白质2 2脱氧核糖核酸 DNA 2 3核糖核酸 RNA 2 4核酸与蛋白质复合物 Nuclearacids ProteinComplex 2 5细胞 Cell 2 6病毒 Virus 3 原子力显微镜对生物分子之间力谱曲线的观测 1 AFM对生物细胞的表面形态观察AFM可以用来对细胞进行形态学观察 并进行图像的分析 通过观察细胞表面形态和三维结构 可以获得细胞的表面积 厚度 宽度和体积等的量化参数等 例如 利用AFM可以对感染病毒后的细胞表面形态的改变 造骨细胞在加入底物 钴铬 钛 钛钒等 后细胞形态和细胞弹性的变化 GTP对胰腺外分泌细胞囊泡高度的影响进行研究 利用AFM还可以对自由基损伤的红细胞膜表面精细结构的研究 直接观察到自由基损伤 以及加女贞子保护作用后 对红细胞膜分子形态学的影响 2 生物大分子的结构及其他性质的观测研究 2 1蛋白质对于蛋白质 AFM的出现极大的推动了其研究进展 AFM可以观察一些常见的蛋白质 诸如白蛋白 血红蛋白 胰岛素及分子马达和噬菌调理素吸附在图同固体界面上的行为 对于了解生物相溶性 体外细胞的生长 蛋白质的纯化 膜中毒有很大帮助 AFM的缺点 受样品因素限制较大 不可避免 针尖易磨钝 受污染 磨损无法修复 污染清洗困难 针尖 样品间作用力较小 核磁共振 核磁共振的方法与技术作为分析物质的手段 由于其可深入物质内部而不破坏样品 并具有迅速 准确 分辨率高等优点而得以迅速发展和广泛应用 已经从物理学渗透到化学 生物 地质 医疗以及材料等学科 在科研和生产中发挥了巨大作用 大约9 的已知蛋白结构是通过核磁共振技术来测定的 核磁共振波谱属于吸收光谱 与此不同的是 紫外 可见光谱 是由分子或原子的外层电子能级间的跃迁所引起的 红外吸收光谱来源于分子振动 转动能级的跃迁 它是由原子核能级的跃迁所引起的 目前在生物学研究领域中常用的有1H 13C 15N 31P 19F的NMR波谱 核磁共振定义 具有自旋运动的原子核在强恒定磁场作用下产生能级分裂 即原子核自旋磁矩分裂为两个能级 如果在垂直于恒定磁场方向外加一射频电磁波 其能量正好等于两相邻分裂能级的能量差时 原子核将吸收此能量而从低能级向高能级跃迁 这一现象称为 核磁共振 核磁共振 NMR 技术是珀塞尔 Purcell 和布洛齐 Bloch 始创于1946年 自1950年应用于测定有机化合物的结构以来 发展十分迅速 经过几十年的研究和实践 现已成为测定有机化合物 生物大分子等结构 构型 构象 分子动态等不可缺少的重要手段 核磁共振成像 MagneticResonanceImaging MRI 磁共振成像 更是将临床活体诊断变成现实 原则上说 凡是自旋量子数不等于零的原子核 都可发生核磁共振 如1H 13C 19F 31P等 但目前在有机结构测定中最常用的实际上只有1H和13C 1H核磁共振谱简称氢谱 用1HNMR表示 13C核磁共振谱简称碳谱 用13CNMR表示 本章仅讨论氢谱 Purcell Bloch 1946年Stanford的Bloch和Harvard的Purcell各自独立观察到核磁共振现象 1952年获得诺贝尔物理奖 恩斯特R R Ernst 1933 瑞士物理化学家瑞士1991年诺贝尔化学奖 主要成就在于他在发展高分辨核磁共振波谱学方面的杰出贡献 这些贡献包括 1 脉冲傅利叶变换核磁共振谱2 二维核磁共振谱3 核磁共振成像 瑞士的Ernst由于在PFT NMR及2DNMR二方面的贡献而获得1991年诺贝尔化学奖 2DNMR 2002瑞士核磁共振波谱学家库尔特 维特里希 KurtW thrich 教授由于 发明了利用核磁共振 NMR 技术测定溶液中生物大分子三维结构的方法 而同美国科学家约翰 芬恩 日本科学家田中耕一获得2002年诺贝尔化学奖 库尔特 维特里希 KurtW thrich 瑞士W thrich首先将2D NMR的方法用于蛋白质 发展了将2D NMR和距离几何结合得到蛋白质在溶液中的空间结构的方法 第一个用NMR方法解析出蛋白质的空间结构 获得2002年诺贝尔化学奖 2003年度的诺贝尔生理 医学奖授予美国伊利诺大学的化学 生物物理学和计算生物及生物工程学教授PaulC Lauterbur和英国诺丁汉大学物理学教授PeterMansfield爵士 以表彰他们对建立磁共振成像 magneticresonanceimaging MRI 技术所做出的杰出贡献 MRI的发明是医学科学研究和临床诊断的一个重要突破 该技术不但可以显示活体组织的精细结构 如大脑的白质和灰质 而且具有无损伤性或非侵入性 noninvasive 即既不用射线照射也无需注射放射性同位素 PaulC Lauterbur和PeterMansfield 原则上说 凡是自旋量子数不等于零的原子核 都可发生核磁共振 如1H 13C 19F 31P等 但目前在有机结构测定中最常用的实际上只有1H和13C 1H核磁共振谱简称氢谱 用1HNMR表示 13C核磁共振谱简称碳谱 用13CNMR表示 本章仅讨论氢谱 核磁共振基本原理 质子是一个微小的带电体 质子自旋时 沿旋转轴方向产生环形电流 环流又导致产生一个感应磁场 其方向与旋转轴重合 因此 可以把一个自旋的原子核看作一块微小的磁铁 质子有两个自旋量子数ms为 1 2和 1 2的自旋态 能量相等 质子取这两个自旋状态的机会也相等 核磁共振现象氢原子核的磁矩在无外磁场影响下 取向是紊乱的 在外磁场H0中 它的取向是量子化的 只有两种可能的取向 当ms 1 2时 磁矩取向与外磁场方向平行 能量较低 为低能态 低能级 当ms 1 2时 磁矩取向与外磁场方向相反 能量较高 为高能态 高能级 图氢原子核在外加磁场中的取向 H0 高能态和低能态两个能级之差为 E 与外加磁场的磁场强度 H0 成正比 即有如下关系式 其中 为旋核比 是一个核常数 h为Planck常数 6 626 10 34J s 这种关系可以形象地用图表示如下 给处于磁场H0中的质子施加一电磁波 称为射频 辐射 并连续改变射频频率 当辐射提供的能量h 恰好等于质子两种取向的能量差 E 时 质子就吸收电磁辐射的能量 从低能级跃迁至高能级 这种现象称为核磁共振 质子共振频率和磁场强度的关系 反过来 如果固定射频频率 即固定射频能量h 而连续改变磁场强度H0 也就是改变质子两种自旋态的能量差 E 当质子两种自旋态的能量差 E 恰好等于辐射所提供的能量h 时 质子也吸收电磁辐射的能量 发生共振 由于连续 精确地改变射频频率在技术上不如连续改变磁场强度 对于电磁铁而言 改变电流强度即可 容易实现 因此 核磁共振谱仪基本上都是固定射频频率 通过改变磁场强度实现核磁共振的 通常称为扫场 仪器的规格级别也常用 多少兆 赫 表示 例如 60MHz 90MHz 300MHz 800MHz等 下图是核磁共振谱仪的基本原理示意图 其中 装有样品的样品管放在电磁铁的两极之间 用恒定频率的无线电波照射通过样品 用扫描发生器向电磁铁的线圈中通直流电流 使磁场强度逐渐增加 当场强达到一定的值H0时 样品中某一类质子发生能级跃迁 产生吸收 接受器就会收到信号 由记录器记录下来 得到核磁共振谱 在1950年 Proctor等人研究发现 质子的共振频率与其结构 化学环境 有关 在高分辨率下 吸收峰产生化学位移和裂分 如图所示 由有机化合物的核磁共振图 可获得质子所处化学环境的信息 进一步确定化合物结构 乙醇的高分辨核磁共振谱 X 射线晶体衍射 1912年德国物理学家M von劳厄预言晶体是X射线的天然衍射光栅 此后英国物理学家W H 布喇格和W L 布喇格开创了X射线晶体学几十年来 这门学科不断发展和完善 测定了成千上万个无机和有机化合物的晶体和分子结构直到1954年英国晶体学家M F 佩鲁茨等人提出在蛋白质晶体中引入重原子的同晶置换法之后 才有可能测定生物大分子的晶体结构1960年英国晶体学家J C 肯德鲁等人首次解出一个由153个氨基酸组成 分子量为17500的蛋白质分子 肌红蛋白的三维结构 说明构成分子的4个亚基呈四面体配置 每一个亚基具有与肌红蛋白相类成分子的4个亚基呈四面体配 每个亚基具有与肌红蛋白相类似的结构20世纪80年代初 已有近200个蛋白质 核酸等生物大分子的三维结构被测定 从而有力地推动了分子生物学的发展中国继20世纪60年代首次人工合成牛胰岛素之后 于20世纪70年代初测定了三方二锌猪胰岛素的三维结构1986年中国已经完成这个结构1 2埃高分辨率的修正 利用射线研究晶体结构中的各类问题 主要是通过X射线在晶体中产生的衍射现象 当一束X射线照射到晶体上时 首先被电子所散射 每个电子都是一个新的辐射波源 向空间辐射出与入射波同频率的电磁波 可以把晶体中每个原子都看作一个新的散射波源 它们各自向空间辐射与入射波同频率的电磁波 由于这些散射波之间的干涉作用 使得空间某些方向上的波则始终保持相互叠加 于是在这个方向上可以观测到衍射线 而另一些方向上的波则始终是互相是抵消的 于是就没有衍射线产生 X射线 X射线管 X射线检测 专门存储蛋白质和核酸分子结构的蛋白质数据库中 接近90 的蛋白质结构是用X射线晶体学的方法测定的 射线晶体学可以通过测定蛋白质分子在晶体中电子密度的空间分布 在一定分辨率下解析蛋白质中所有原子的三维坐标 蛋白质结构测定的基本步骤 结晶衍射数据收集确定位相晶体结构的拟合 修正和确认 一 结晶 晶体是由空间排列得很有规律的微粒 原子 离子 分子等 组成的 结晶要求有序地形成大的 尺寸在每个轴上都超过0 1mm 稳定的晶体 以求有足够的长度范围来衍射X射线 由X射线衍射产生的结构的好坏依赖于产生这些衍射晶体的质量要求溶液中的蛋白质处于过饱和状态 并只形成少数的成核中心 使晶体能持续地慢慢形成少数的成核中心 地生长成大单晶 蛋白质晶体的例子 1 结晶基本过程 需要浓度在0 5 200mg ml的纯的蛋白质溶液 然后加入试剂把蛋白质的溶解度降到接近于沉淀点这些试剂打乱了蛋白质 溶液的相互作用 所以平衡转移 更倾向于蛋白质 蛋白质联合进一步提高溶液浓度就可以形成成核位点 这是晶体形成过程中很难的一步 是结晶三个基本步骤的第一步 对所有体系都适用成核位点形成后就是延伸过程当晶体达到限制大小的时候停止延伸 2 蛋白质溶液形成晶体的两种实验方法 蒸汽扩散法 蛋白质结晶中使用的标准方法 小体积比较合适 容易建立且易于监测反应进度平衡透析法 在具有高或低离子强度的蛋白质结晶中使用 二 衍射数据收集 照相法 用底片收集衍射点 然后通过自动扫描微光密度计测量强度数据面积探测器法 用面积探测器 它能一次同时记录一批衍射线的强度 具有兼顾测量的速度和精度 批衍射线的强度 具有兼顾测量的速度和精度 以及晶体定位方便的优点 因此已被广泛采用 用实验测定单个晶格的线度和从衍射图中测量衍射点的强度 三 确定位相 根据上述数据 结合其它方法推断原子排列 得到尝试结构模型 计算这种结构的衍射极大值 然后与实验观察值比较 三 确定位相