植物花药和花粉培养及单倍体育种.ppt

第七章植物花药和花粉培养及单倍体育种 陈观水生命科学学院jimchen7909第七章植物花药和花粉培养及单倍体育种 主要内容 第一节花药与花粉培养第二节单倍体育种学习的目标与要求 掌握花药培养和花粉培养技术 掌握花药和花粉培养在单倍体育种中的重要应用 了解我国单倍体育种成就 具有进行花药培养和花粉培养的基本能力 具有单倍体育种认知 初步具备查阅资料收集信息基础能力 植物花药和花粉培养及单倍体育种 植物花药和花粉培养及单倍体育种 一 花药与花粉培养 1 花药培养与花粉培养的概念及意义花药培养 antherculture 将发育到一定阶段的花药剥离下来 切去花丝部分 接种到培养基上进行培养 最终形成完整植株的过程花粉培养 pollenculture 又称小孢子培养 microsporeculture 或游离小孢子培养 isolatedmicrosporeculture 是指在无菌条件下 将花粉从花药中游离出来 使其分散或游离态 发育成单倍体植株的过程 一 花药与花粉培养 一 花药与花粉培养 1 花药培养与花粉培养的概念及意义两者之间的异同 培养目的相同 均获得小孢子植株 花药培养其外植体是植物雄性生殖器官的一部分 就培养方法和技术来讲 属于器官培养 而花粉培养属于细胞培养 花粉培养没有药壁组织干扰 可计数小孢子产胚率 可观察雄核发育的全过程 单倍体产量高 但技术更复杂 一 花药与花粉培养 1 花药培养与花粉培养的概念及意义植物花药与花粉培养的意义获得纯系材料进行单倍体育种 提高育种效率利用获得的纯合二倍体材料进行植物遗传规律研究 为遗传育种提供依据 减少育种的盲目性 克服远缘杂种的不育性 获得具有双亲优良特性的可育远缘杂种利用在远缘杂交F1代花药培养中出现的混倍体和丰富的染色体变异材料进行基础性研究 一 花药与花粉培养 1 花药培养与花粉培养的概念及意义常规育种需4 6年获得纯系 而小孢子培养仅需一年 一 花药与花粉培养 2 花药培养 一 花药与花粉培养 2 花药培养 雄蕊原基 花药原始体 表皮 破损 孢原细胞 4组 初生壁细胞 3 多层 外层为药室内壁 纤维层 中层 1 3层 破坏 内层为绒毡层 解体 花粉囊壁 药隔和维管束 减数分裂 四分体 单核花粉粒 造孢细胞 花粉母细胞 一 花药与花粉培养 2 花药培养花药培养的基本程序是 培养材料的选择 材料 花蕾 预处理 外植体消毒灭菌 接种培养 植株再生 诱导生根 单倍体植株的染色体加倍及驯化移栽 一 花药与花粉培养 2 花药培养1 培养材料的选择需注意以下问题 材料的基因型供体植株生长条件和生理状态花粉发育时期 单核期 尤其是单核中 晚期 单核靠边期 一 花药与花粉培养 2 花药培养2 材料的预处理预处理是小孢子培养成功的前提条件预处理目的 是改变小孢子的发育方向 使尽可能多的小孢子从配子体发育途径转向孢子体发育途径 即成为具胚胎发生潜力的小孢子 适当的预处理能使绿苗产量大量增加 预处理方法 主要是对花药进行适度的逆境处理 包括低温 高温 化学物质 离心 射线等 一 花药与花粉培养 2 花药培养3 外植体消毒4 接种5 培养6 植株再生7 生根8 驯化与移载9 单倍体植株的染色体加倍 一 花药与花粉培养 2 花药培养 旗叶鞘用70 酒精擦洗一遍 剥去旗叶鞘 取出稻穗 10 漂白粉10min 无菌水洗3次 培养5天 花药变褐 20天后花药裂开 长出淡黄色的花粉愈伤组织 先长芽 后长根 形成幼苗 用接种环接种到培养基上 左手持穗 右手用镊子取花药 放无菌培养皿中 水稻花药培养过程 一 花药与花粉培养 2 花药培养 FigureAnthercultureandhaploidplantsregenerationAntherattheonsetoftheculture b Antherafter6daysinculture c d Embryosemergingfromtheanthersafter30daysinculture showingroots c andshoots d 一 花药与花粉培养 一 花药与花粉培养 3 花粉培养习惯上 把处于四分体到单核早期的花粉称小孢子 进入单核以后则称为花粉 花粉培养成苗途径与花药培养比较 相同点 胚状体成苗途径 愈伤组织再分化成苗途径不同点 花粉培养 花粉分离收集及培养方式 需进行花粉的分离特殊的花粉诱导培养 一 花药与花粉培养 3 花粉培养花药有药壁 2n 药隔 2n 花粉 n 等 因此 再生植株有可能来自药壁 2n 药隔 2n 或起源于数个花粉 n 的嵌合体 游离花粉粒培养 再生植株为纯合体 一 花药与花粉培养 3 花粉培养优点 与花药培养比 a 花药培养容易受药壁 花丝 药隔等体细胞组织的影响 再生植株会出现不同倍性的个体 而分离的花粉培养可以克服这一不足 b 能更好调节控制核发育的各种因子 而且可以直接从单细胞开始观察整个雄核发育的过程 为研究雄核的生理生化等问题提供方便 c 原则上将 从花粉培养能得到更多的花粉植株 一 花药与花粉培养 3 花粉培养花粉分离收集 由于花粉包于花药内 必须将它们从花药中分离 收集才能进行培养 方法 1 机械挤压法 主要有挤压法和研磨过滤收集法挤压法 是将花药消毒后 加入少量的分离溶液 用镊子或小玻璃棒将花粉从花药中挤压出来 通过不锈钢网或尼龙网筛去组织碎片 收集悬浮液 然后用30 蔗糖离心收取悬浮在蔗糖溶液上层的完整花粉粒 再用培养基洗涤几次后用于培养 一 花药与花粉培养 3 花粉培养花粉分离收集1 机械挤压法研磨过滤收集法 在无菌条件下 将采集到的花蕾经表面消毒后剥离出花药 再将花药置于无菌的研钵中研磨并挤出小孢子 同时滤去药壁等大的组织碎片 经离心收集后接种于适宜培养基上进行培养的方法 2 自然散落法 将花药接种于液体培养中 使花粉自然释放 再进行收集培养 一 花药与花粉培养 3 花粉培养花粉分离收集3 机械游离法 主要有磁搅拌法和小型搅拌法 磁搅拌法 利用机械力使花药壁破裂至花粉溢出的方法 小型搅拌法 又称超速旋切法 是通过转轴的高速转动带动花蕾 穗子切段或花药高速运动而使之破裂 从而使小孢子游离出业 经过分级过筛收集后进行培养 一 花药与花粉培养 3 花粉培养花粉分离收集花粉纯化 需经过筛 梯度离心 收集等步骤 梯度离心前 小孢子形态 活力不一致 30 蔗糖梯度离心后 获得均一的小孢子群体 一 花药与花粉培养 3 花粉培养花粉的培养方法 与第五章相似平板培养花粉置琼脂固化培养基上培养 液体培养花粉悬浮在液体培养基中培养 需震荡 以利通气 双层培养花粉置固体 液体双层培养基上培养 培养基制作方法 先铺一层琼脂固体培养基 凝固后 在表面加入少量液体培养基 看护培养利用花药或花药愈伤组织释放出的活性物质促进花粉小孢子发育 微室培养利用小的盖玻片和凹穴载玻片形成微室进行花粉培养条件培养利用培养过花药的液体培养基或含失活花药提取物的培养基上培养 花药条件培养基 子房条件培养等 一 花药与花粉培养 3 花粉培养 取花蕾 镜检 取花药 一 花药与花粉培养 4 影响花药培养和花粉培养的因素基因型 不同基因型的培养难易及植株再生有很大差别 植株的生理状态和环境条件 母体植株的年龄和所经历的环境条件如 光周期 光照强度 温度等对以后的花粉离体培养有很大影响 一般田间比温室 幼龄比老龄植株易于培养 一 花药与花粉培养 4 影响花药培养和花粉培养的因素花粉的发育时期 只有发育到某一时期的花粉对离体刺激才最敏感因此选择合适的花粉发育时期的花药很关键 多数植物单核期的花粉培养容易成功 培养基 基因型不同 所需培养基种类 蔗糖浓度以及添加激素种类和浓度不同 加入活性炭可提高花粉植株的诱导率 花药组织的存在对小孢子的胚性分裂具有明显的促进作用 但花药壁损伤会释放有毒物质影响小雄核的发育 一 花药与花粉培养 4 影响花药培养和花粉培养的因素预处理 花粉或花药从植株上取下来直接培养 往往诱导频率极低 采用低温 高温 离心等预处理方法可以促进花粉启动 提高再生频率 培养条件接种密度 一 花药与花粉培养 5 离体条件下小孢子发育成植物体的途径根据小孢子最初几次分裂方式的不同小孢子 均等细胞 发育途径 途径 单核小孢子有丝分裂形成2个等同的子细胞营养细胞发育途径 途径 单核小孢子进行一次正常的非均等分裂后 营养细胞继续分裂生殖细胞发育途径 途径 单核小孢子进行一次正常的非均等分裂后 生殖细胞继续分裂生殖细胞和营养细胞 不均等细胞 发育途径 途径 单核小孢子进行非均等分裂后 生殖细胞和营养细胞均继续分裂 参与孢子体的形成 一 花药与花粉培养 5 离体条件下小孢子发育成植物体的途径 一 花药与花粉培养 6 单倍体植株鉴定及染色体加倍单倍体植株倍性鉴定 为什么要进行倍性鉴定 诱导效率低 且获得的花粉植株是混合群体 1 直接鉴定 也叫染色体直接计数法 通常取根尖 茎尖等分生组织区进行制片 直接计数染色体数目 一 花药与花粉培养 6 单倍体植株鉴定及染色体加倍单倍体植株倍性鉴定2 间接鉴定扫描细胞光度仪鉴定 流式细胞仪 主要测定叶片单个细胞中DNA的含量确定细胞的倍性 材料的使用量可少到1cm2 细胞形态学鉴定法 叶片保卫细胞大小 单位面积上的气孔数及保卫细胞中叶绿体的大小和数目与倍性具有高度的相关性 一 花药与花粉培养 6 单倍体植株鉴定及染色体加倍单倍体植株倍性鉴定2 间接鉴定植株形态学鉴定法 单倍体植株瘦弱 叶片窄小 花小柱头长 花粉粒小 不结实 DNA含量测定核体积测量法生化与分子标记鉴定 一 花药与花粉培养 6 单倍体植株鉴定及染色体加倍单倍体植株的染色体加倍为什么要进行染色体加倍 对单倍体植株进行加倍主要采用化学诱变法 常用的诱导剂包括秋水仙素 8 羟基喹啉 对二氯苯等 其中秋水仙素最好 主要有以下几种方法 1 小苗处理法2 茎尖处理法3 培养基处理法 一 花药与花粉培养 花药和花粉培养基本流程 一 花药与花粉培养 7 花药与花粉培养操作实例 略 二 单倍体育种 1 单倍体育种的概念和意义单倍体 haploid 指细胞中含有正常体细胞的一半染色体数 即具有配子染色体数目的个体 单倍体育种 haploidbreeding 指将具有单套染色体的单倍体植物 经人工染色体加倍 使其成为纯合二倍体 从中选出具有优良性状的个体 直接繁育成新品种 或选出具有单一优良性状的个体 作为杂交育种的原理材料 二 单倍体育种 1 单倍体育种的概念和意义问 单倍体是不是就是一倍体 水稻是二倍体 其单倍体是一倍体 n x 12 普通烟草是异源四倍体 单倍体是二倍体 n 2x Ts 24 普通小麦是异源六倍体 单倍体是三倍体 n 3x ABD 21 二 单倍体育种 1 单倍体育种的概念和意义单倍体育种的意义良好的遗传研究材料加速育种进程提高选育效率突变体选育遗传转化受体利用单倍体育种对栽培品种进行纯化 二 单倍体育种 二 单倍体育种 2 单倍体育种技术1 自发单倍体的发生方式孤雄生殖途径产生自发单倍体孤