流式细胞仪原理及应用(HIV)PPT课件.ppt

碧迪医疗器械 上海 有限公司上海市静安嘉里中心3座10楼李苏辉 流式细胞仪原理及仪器维护保养 白细胞的组成 白细胞的组成及其分化抗原白细胞在分化成熟过程中 不同的发育阶段和不同亚类的白细胞出现或消失的表面标记 这是区分白细胞的重要标志 1986年世界卫生组织命名委员会建议应用CD系列来统一命名白细胞分化抗原 2 SHA LFR032 20080930 4N13EforJerel 细胞毒性T淋巴细胞 分泌穿孔素 IFN TNF等 特点 MHC 1类分子限制 直接接触 反复杀伤 自然杀伤细胞 NK 抗体依赖细胞介导的细胞毒作用 淋巴因子介导细胞毒作用 抗体依赖的细胞介导的细胞毒作用 补体系统的活化 经典 凝集素 替代途径 作用 溶胞作用 吞噬条理作用 趋化性 炎症反应等 中和抗原 形成免疫复合物 被吞噬细胞清除 条理作用 毒素中和作用 感染中和作用 体液免疫和细胞免疫的作用 淋巴因子依赖的细胞毒作用 3 免疫应答的过程及Th细胞的作用 免疫应答 细胞免疫体液免疫Th细胞作用 Th1分泌IL 2 INF等 前者可诱导Th Tc分裂增值 Th2分泌IL 4 IL 5 可使B细胞活化 产生抗体B细胞完全活化需要Th帮助 4 流式细胞仪原理 流式细胞术 Flowcytometry 对于处在流动状态的细胞或生物颗粒同时进行多参数的快速的分析和定量的技术 5 BD公司HIV领域流式细胞仪产品 FACSCount流式细胞仪 FACSCalibur流式细胞仪 6 T T C H CD3 CD3 CD8 CD4 流式细胞仪检测原理及在T细胞分析中应用 7 Analyze 8 激发光源与荧光标记物 9 FACSCalibur流式细胞仪仪器结构 液流系统光学系统激光光源光收集系统电子系统光电转换数据处理系统软件系统 10 液流系统 鞘液 11 流式细胞仪原理 12 光学系统 激光 Laser lightamplificationbystimulatedemissionofradiation 是一种相干光源 它能提供单一波长 高强度及稳定性高的光照激光波长 488nm 635nm 13 检测信号 散射光信号FSC 前向角散射光SSC 侧向角散射光 90度散射光 荧光信号荧光染料光学滤片 14 检测信号 15 前向角散射光信号 16 前向角散射光信号 17 散射光信号 前向角散射光信号 FSC FSC Forward AngelLight Scatter在激光束正前方的检测器 为前向散射光检测器FSC的强度与细胞或其他颗粒的大小 形状及opticalhomogeneity有关FSC用于检测细胞或其他粒子的表面属性如 大小 18 侧向角散射光信号 19 侧向角散射光信号 20 侧向角散射光信号 SSC SSC Side AngelLight Scatter与激光束垂直方向的检测器为侧向检测器 也称为90度散射光检测器SSC的强度与细胞或其他颗粒的大小 形状及opticalhomogeneity有关SSC用于检测细胞内部结构如 胞浆内颗粒多少 核质比 21 流式细胞仪的检测信号 散射光 FSC 前向角散射光 代表细胞大小SSC 侧向角散射光 代表细胞粒度 RightAngleLightDetector CellComplexitySSC ForwardLightDetector CellSurfaceAreaFSC IncidentLightSource 22 荧光信号 每种荧光染料均有特定的激发波长 并激发后会有发射波长 流式细胞仪检测的即是它特定的发射波长 利用各种不同波长的光学滤片来收集 检测 这些光学信号 23 光学系统 FCM的光学系统是由若干组透镜 滤波片 小孔组成 24 光路 滤片特性 长通滤片 允许长于设定波长的光通过短通滤片 允许短于设定波长的光通过带通滤片 允许一定带宽的波长通过 25 460500540 460500540 460500540 SP500 LP500 BP500 50 长通短通带通 光学滤片 26 荧光信号 27 荧光信号 28 光路 滤片特性 当以45o角放置长通滤片时 该滤片可以通过一定波长的光 同时也可以阻断并折射该波长以下的光这种方式的滤片称为二向色性长通滤片 dichroicfilter 29 30 光学系统 31 电子系统 当细胞携带荧光素标记物 通过激光照射区时 受激激发 产生代表细胞内不同物质 不同波长的荧光信号 这些信号经A D转换成数字信号 送计算机进行储存 作图 统计分析 32 发射波长 Wavelength nm 400 450 500 550 600 650 700 1000 800 600 400 200 0 PE FITC PerCP 750 33 流式细胞仪原理 荧光信号 650nm 700nm 500nm 600nm RelativeIntensity Wavelength nm 550nm 34 检测器 Photomultipliertube PMT 将光学信号转变为电脉冲 数字数据 信号 35 单平台绝对计数 管中预先加有准确定量的Beads流式细胞仪获取数据后 由各目标群的含量 可以计算出相对含量 由各目标群与Beads的相对量计算 得到该细胞群的绝对含量计算公式 细胞获取数Beads总量细胞 L Beads获取数样本量注 Beads总量见TruCOUNT管外包装MultiSET系统中 样本量为50 L 36 单平台绝对计数 使用TriTEST或MultiTEST试剂 在TruCOUNT管中完成全血的淋巴细胞绝对计数TruCOUNT管中预先加有准确定量的Beads 每批TruCOUNT管的Beads含量一致由各目标群与Beads的相对量计算 得到该细胞群的绝对含量使用直接荧光标记抗体组合 一步处理外周血使用免洗技术 溶血后直接上机检测标本操作简便 省时省力 计数结果重复性好 37 淋巴细胞分析 使用特异的单克隆抗体 进行多色分析 同时分析淋巴细胞上多种抗原的表达 可以将淋巴细胞亚群区分开 进行定量分析淋巴细胞分析TriTEST 三色试剂CD4 CD8 CD3 CD3 CD4 CD45MultiTEST 四色试剂CD3 CD8 CD45 CD4TruCOUNT 单平台绝对计数管报告Th Ts Th Ts百分含量 与绝对含量cells uL 38 TriTESTCD4 CD8 CD3 TLymphEventsCD3 CD4 TLymphCD3 CD8 TLymphCD3 CD4 CD8 TLymphTH SRatio BeadEventsCD3 AbsCntCD3 CD4 AbsCntCD3 CD8 AbsCntCD3 CD4 CD8 AbsCnt 39 淋巴细胞四色分析 LymphAbsCntCD3 LymphCD3 AbsCntCD3 CD4 LymphCD3 CD4 AbsCntCD3 CD8 LymphCD3 CD8 AbsCntCD3 CD4 CD8 LymphCD3 CD4 CD8 AbsCntTH SRatio 40 MultiTESTCD3 CD8 CD45 CD4 MultiTESTCD3 CD15 56 CD45 CD19 41 FacsCalibur仪器样本操作 仪器校正 加入校正试剂内的液体必须和鞘液桶的一样 样本操作 溶血 有凝块的血不要做加样前 抗凝血颠倒混匀8 10次 避免混匀器混匀 使用反向加样法 枪头贴壁 加样枪在试管内不要放松 42 FACSComp没有通过怎么办 FSC或SSC没有通过 原因 1 由于仪器的管路没有清洗干净2 使用的鞘液杂质太多 换鞘液 BD公司专用鞘液3 校准品失效4 仪器故障措施 1 用蒸馏水高速运行仪器10分钟 30分钟2 过滤鞘液3 使用新的校准品4 致电BD工程师 43 FacsCalibur仪器 BD原装鞘液 过滤 消毒 0 22um滤膜过滤鞘液桶放入3升鞘液 不要放满 清除废液桶废液 装200毫升漂白剂先开仪器再开电脑在按Prime按钮去除流动池气泡时 上样架处在偏离位置做好每日维护 建议每次关机时做FacsClean和FacsRinse清洗 1 FacsClean RunHi支架旁位2分钟 支架正位3分钟 2 FacsRinse 步骤同上 3 蒸馏水 RunHi2分钟旁位 5分钟正位 4 去除鞘液压力 5 选择Standby模式10分钟后关机月维护中鞘液桶装入FacsClean 0 5 1 的漂白剂 旁路鞘液过滤器 每3个月 6个月清洗空气过滤网 用水冲洗再晾干 过滤器6个月更换 44 FACSCount 45 仪器性能 样本稳定性制备后室温 20 250C 储存48小时全血稳定性采集后室温 20 250C 储存48小时 46 FacsCount样本处理 FacsCount质控 正常血 样本用前颠倒混匀 避免混匀器上混匀 反向加样法 枪头贴管壁 分离最后一滴 试剂在开盖前可以在混匀器上颠倒混匀每次更换枪头 样本多时 每次更换试剂对管管盖加入固定液后30分钟以后再操作更安全 47 FacsCount仪器 用水冲洗开盖器 用轻柔的去污剂或70 酒精清洗电子加样枪 用1 10的漂白剂清洗Workstation避免在废液桶里装高浓度的漂白剂每次试验结束后废液桶必须清空 然后用自来水冲洗 建议关机后取出废液桶 下次实验时再放置在仪器里电子加样枪不用时需从支架上取下 软盘复制 已做过质控的软盘作为母盘 连续做15个标本需要做清洗 如果试验中间中断1小时以上 需要清洗 将装有蒸馏水的上样管置于上样针位置 保持上样针湿润 防治结晶 关机 如果长时间不做试验 建议每周用蒸馏水清洗 48 FacsCount仪器 FacsCount的每日维护 1 运行CLEAN程序 2 上样管放置稀释的FacsClean 稀释10倍次氯酸钠 3分钟3 再放置装有FacsRinse Tween稀释10倍1 00 上样管清洗3分钟4 重新执行CLEAN程序 FacsRinse Tween稀释10倍1 00 再洗3分钟5 放置装有蒸馏水的上样管清洗3分钟6 试验结束后 放置装有蒸馏水的上样管浸泡上样针 避免管道结晶6 仪器无用时建议取出废液桶 49 FacsCount仪器 FacsCount的长冲洗 1 短路过滤器 并在鞘液桶内和试管中放置稀释5倍的次氯酸钠2 运行CLEAN程序 二个循环 后进入UTILITY程序 按 Shutdown 键 使上样针浸泡在装有次氯酸钠的试管中 将仪器电源关掉 让仪器管道浸泡30分钟2 倒掉鞘液桶内的次氯酸钠 将鞘液桶洗干净 换上干净的 蒸馏水或纯净水