第十九章补体检测及应用ppt课件.ppt

第十九章补体检测及应用 第一节概述 一 补体的性质 1 补体的概念与来源 补体 complement C 又称补体系统 是一组存在于人和脊椎动物血清与组织液中具有酶样活性 不耐热和功能上连续反应的糖蛋白 包括30余种可溶性蛋白和膜结合蛋白 是抗体发挥溶细胞作用的必要补充条件 体内多种组织细胞均能合成补体成分 其中肝细胞和巨噬细胞是补体的主要产生细胞 2 补体系统的组成 补体并非单一成分 是由30余种活性成分组成的补体系统 是体内最复杂的一个限制性蛋白酶解系统 limitedproteolysissystem 按其生物学功能分为三类 1 补体系统的固有成分 指存在于体液中参与补体激活过程的补体成分 经典激活途径 C1q C1r C1s C4 C2 甘露聚糖结合凝集素激活途径 MBL 丝氨酸蛋酶 旁路激活途径 B因子 P因子 D因子 共同末端通路 C3 C5 C6 C7 C8 C9 2 补体调节蛋白 指参与调控补体活化的抑制因子或灭活因子 多以其功能命名 C1抑制物 C1inhibitor C1INH C4结合蛋白 C4BP I因子 H因子 S蛋白和膜协同因子蛋白 membranecofactorprotein MCP 3 补体受体 complementreceptor CR 指介导补体活性片段或调节蛋白生物学效应的各种受体 以其结合对象来命名 如C1rR C5aR C3aR C1qR 对C3片段的受体则用CR1 CR5表示 调节蛋白的受体 3 补体系统的命名原则 参与补体经典激活途径的固有成分 按其被发现的先后分别命名为 C1 q r s C2 C9 补体系统的其他成分则以因子命名 用英文大写字母表示 如B因子 D因子 P因子 补体活化后的裂解片段以该成分的符号后加小写英文字母表示 通常a为小片段 b为大片段 但C2a为大片段 C2b为小片段 具有酶活性的成分或复合物在其字符上画一横线表示 如等 灭活的补体片段在其字符前加英文字母i表示 如失活的C3b称为iC3b 补体调节蛋白多以其功能命名 C1抑制物 C4结合蛋白等 4 补体的性质 补体大多为糖蛋白 其中C1q分子量最大 D因子最小 血清蛋白电泳中 补体大多位于 球蛋白区 少数位于 或 球蛋白区 如C1q C8等为 球蛋白 C1s C9为 球蛋白 正常血清中补体含量相对稳定 补体蛋白约占总蛋白量的10 左右 补体各组分含量相差较大 其中C3含量最高 达1 2mg ml Df最低 补体的性质不稳定 较其他蛋白质对理化因素更为敏感 加热 紫外线照射 机械振荡 酸碱和酒精等因素均可破坏补体 在0 10 补体活性保持3 4天 20 以下冷冻或真空干燥可使其活性保持较长时间 标本保存应置于 20 以下 补体灭活 加热56 30min可使血清中绝大部分补体失去活性 故补体活性检测应尽快进行 补体代谢主要在血液和肝脏中进行 代谢率快 每天约更新一半 各种属动物间血中补体含量不同 豚鼠血清中含量丰富 故实验室多采用豚鼠血清作为补体来源 二 补体的活化途径 生理情况下 血清中大多数补体蛋白以酶原形式存在于体液中 一旦被活化物质激活 补体各组分便产生连锁酶促反应即级联 cascade 反应 表现出相应的生物活性 补体的激活途径按起始顺序不同分为三种 经典途径 classicalcomplementpathway 抗原抗体复合物结合C1q启动激活的途径 是抗体介导的体液免疫反应的主要效应形式 替代途径 alternativecomplementpathway 病原微生物等提供结合表面 不经C1 C4 C2的参与 在B因子 D因子 P因子的参与下直接从激活C3开始的途径 是在感染早期 最先发挥作用的途径 经典途径的激活可以导致替代途径的活化 反之则不行 甘露聚糖结合凝集素 mannanbindingtectin MBL 途径 简称MBL途径 MBL结合至细菌而启动激活的途径 此途径不依赖于抗原抗体复合物的形成 在感染的早期就能发挥免疫防御效应 为急性期蛋白途径 1 补体激活的经典途径 主要激活物 IgG3 IgG1 IgG2和IgM类抗体与相应抗原形成的免疫复合物 此外还发现有许多因子可以激活此途径 如细菌脂多糖 dsDNA C 反应蛋白和心肌线粒体等 始动环节 C1q与IC中抗体分子的补体结合位点相结合 IgG分子必须要两个或以上 而IgM一个分子即可激活C1q 激活过程 补体C1 C9共11种成分全部参与的活化途径 经典途径的活化过程可分为识别 活化和膜攻击三个阶段 识别阶段 C1q识别免疫复合物至C1酯酶形成 小片段C1s 活化阶段 活化的C1s依次裂解C4和C2 形成具有酶活性的C3转化酶 和C5转化酶 的过程 经典途径 2 补体激活的替代途径 替代途径的激活剂 某些细菌 革兰氏阴性菌的内毒素 细菌的脂多糖 肽聚糖 葡聚糖 酵母多糖 凝聚的IgG4和IgA聚合物等 激活过程 C3是启动替代途径并参与其后级联反应的关键分子 经典途径产生或自发产生的C3b与B因子结合 血清D因子的作用 形成C3转化酶 不稳定 与血清P因子结合则形成稳定的C3转化酶 C3转化酶水解C3 形成C5转化酶 或 激活的特点 可以识别自己与非己 C3b的中止与激活替代途径是补全权系统重要的放大机制 替代途径C3转化酶对经典途径补体的活化是一种放大机制 3 MBL途径 激活物 病原微生物感染所诱导产生的急性期蛋白 如MBL CRP等 激活过程 MBL与细菌的甘露糖残基结合 再与丝氨酸蛋白酶结合 形成MBL相关的丝氨酸蛋白酶 MASP 1 MASP 2 MASP具有与活化的C1q同样的生物学活性 可水解C4和C2 形成C3转化酶 其后过程与经典途径相同 激活特点 MBL途径开始于急性期蛋白与病原体的结合 而不是抗原抗体复合物形成 4 共同末端效应 C5转化酶裂解C5是补体级联反应中最后一个酶促步骤 若补体激活发生在脂质双层上 则形成MAC 若补体激活发生在没有靶细胞的血清中则有关补体成分可同S蛋白形成亲水的无溶细胞活性的SC5b 7 SC5b 8及SC5b 9 6 三种激活途径的比较 5 三种激活途径的示意图 三种途径比较 6 7 补体激活的调控 机体必须有严密的补体调控机制 正常生理情况下补体激活是机体的一种保护性反应 失控的补体激活反应可使大量补体无益消耗 产生剧烈的炎症反应以及造成机体自身组织细胞的病理性损伤 补体的调控方式 补体成分的自身衰变和各种补体调节因子的作用 自身衰变的调节 被激活后的补体蛋白往往不稳定 补体裂解片段C4b C3B C5b呈游离状态时会迅速衰变 须与细胞膜结合才能产生补体的级联反应 C3转化酶和C5转化酶亦极易衰变 从而限制后续补体成分的酶促激活反应 与细胞膜结合的C5也可自行衰变 使MAC无法大量形成 调节蛋白的调节 补体激活启动阶段的调节 对单一补体蛋白转化酶的调节 对MAC形成的调节 某些细胞表面存在的补体受体分子也参与补体活化的调节 C1抑制物 C1INH 以共价结合C1r C1s 防止C1的自发激活 亦可使C1酯酶失去裂解C4和C2的能力 C4结合蛋白 C4bp 竞争性抑制C4b与C2的结合 阻止C3转化酶的形成 促进分解 从中置换出C2b使C3转化酶失活 辅助I因子裂解游离的C4b H因子 竞争性抑制B因子与C3b的结合 阻止C3转化酶的形成促进I因子灭活C3bI因子 在C4bp和H因子的协同作用下可使C4b和C3b裂解 S蛋白 与C5b67结合 阻止其插入细胞脂膜而抑制MAC形成 同种限制因子 HRF 与C8蛋白结合而干扰C9和C8相结合 使自身细胞膜上不能形成MAC 衰变加速因子 DAF 竞争性抑制B因子与C3b的结合 阻止C3转化酶的形成 促进分解 从中置换出C2b使C3转化酶失活 三 补体的生物学功能 补体系统的生物学作用分为两大类 补体在细胞膜表面激活并形成MAC 介导细胞溶解 补体裂解片段介导的各种生物学效应 补体系统的生物学功能 补体介导的细胞溶解作用 调理吞噬和免疫粘附作用 是机体抗感染的主要防御机制 补体的调理吞噬 补体裂解片段C3b C4b iC3b等可与细菌 病毒等颗粒性物质结合 促进吞噬细胞对其吞噬 免疫粘附作用 C3b与病毒或IC等结合后 可介导后者与具有C3b受体的人RBC PLT等结合 从而有利于吞噬细胞捕获和清除 炎症介质作用过敏毒素作用 C5a C3a C4a与细胞表面的相应受体结合 能使肥大细胞 嗜碱性粒细胞脱颗粒激肽样作用 C2a C4a可引起炎性渗出和水肿趋化作用 C5a C3aS可使N定向移动 清除免疫复合物作用抑制IC的形成 空间位阻效应促进IC的清除 C3b介导免疫粘附免疫调节作用C3可参与捕捉并固定抗原 通过与抗原提呈细胞上的CR1及CR2受体结合 使抗原易被APC处理和提呈作用于多种免疫细胞 调节细胞的增殖分化 C3b与B细胞表面CR1结合 促进B细胞增殖分化参与调节多种免疫细胞效应功能 NK结合C3b增强ADCC作用 第二节补体总活性测定 补体总活性测定是对激活后补体最终效应的检测方法 可借此反映补体的整体功能 补体总活性测定方法是以红细胞的溶解为指示 以50 溶血为判断终点 称为CH50 补体活化途径不同 应用不同的激活物可活化不同的补体途径 基于经典途径的CP CH50 临床常规项目 CH50 应用于C3旁路检测的AP CH50 尚未列入检验常规 MBL途径活性测定的可靠方法暂未建立 一 CH50测定法的实验原理 补体最主要的活性是溶细胞作用 特异性抗体与红细胞结合后可激活补体 导致红细胞表面形成跨膜小孔 使胞外水分渗入 引起红细胞肿胀而发生溶血 应用绵羊红细胞 sheepredbloodcell SRBC 和其相应的抗体 溶血素 作为能诱导补体活化经典途径的指示物和激活剂 补体能使溶血素特异性结合的绵羊红细胞溶解 当溶血素和绵羊红细胞浓度恒定时 溶血程度与补体含量和活性相关 将新鲜待检血清作不同稀释后 加入反应体系 测定溶血程度 以50 溶血时的最小血清用量作为判定终点 可测知补体总溶血活性 补体溶血程度与补体的活性相关 但非直线关系 在一个适当的 稳定的反应系统中 溶血反应对补体的剂量依赖呈一特殊的S形曲线 实验通常以50 溶血作为终点指标 它比100 溶血更为敏感 这一方法称为补体50 溶血实验 50 complementhemolysis 即CH50 S形曲线 以溶血百分率为纵坐标 相应血清量为横坐标 可见在轻微溶血和接近完全溶血时 对补体量的变化不敏感 在30 70 之间最陡 几乎呈直线 补体量的少许变动 也会造成溶血程度的较大改变 即曲线此阶段对补体量的变化非常敏感 溶血程度与补体含量的关系 二 CH50试验方法 正式试验之前 应 调节制红细胞浓度滴定溶血素效价 1 红细胞浓度的调整 绵羊红细胞 sheepredbloodcell SRBC 自绵羊颈静脉无菌采血 注入放有玻璃珠的无菌干燥三角烧瓶中 轻轻旋摇15min 除去纤维蛋白 也可将羊血与等量或2倍量的阿氏 Al sever 液混合 既可抗凝 又适用于储存 分装 4 保存 可用2 3周 实验前 取适量SRBC用生理盐水洗涤2次 第3次用缓冲液洗涤 离心弃上清液 取比积红细胞用缓冲液配制SRBC悬液 浓度一般为2 5 为使每次试验时SRBC的浓度标准化 可吸取少量红细胞悬液 加入20 30倍的稀释液中 在542nm波长处比浊 以吸光度为标准调整红细胞浓度 2 溶血素滴定 溶血素可通过SRBC免疫家兔获得 一般无需纯化 试验前需先行加热56 30min或60 3min以灭活补体 溶血素有商品销售 可按标识效价稀释使用 自行制备的溶血素需进行滴定 确定使用浓度 在补体活性测定中 大多使用2个单位 溶血素效价稳定 一般使用3个月后再作重新滴定 溶血素稀释与滴定方法如下 溶血素稀释一般不用连续倍比稀释法 这是因为稀释到最后跨度太大 不易确定单位 置37 温育后观察结果 以最高稀释度的溶血素仍能产生完全溶血为最大的有效反应管 即确定为1个单位 如1 4000 在补体活性测定或补体结合试验中一般使用2U 即1 2000 试验时用1 1000的溶血素与2 SRBC等量混合致敏 3 稀释缓冲液 磷酸缓冲液或巴比妥缓冲液等均可用于溶血试验 pH调到7 2 7 4之间 加适量NaCl以保持等渗 加适量活化补体必不可少的Ca2 和Mg2 加入0 1 明胶以稳定蛋白溶液 加入0 02 NaN3防腐 以利保存 4 50 溶血标准管 作CH50试验时 应同时配制50 溶血标准管 方法 取2 绵羊红细胞悬液0 5ml 加2 0ml蒸馏水 将SRBC全部溶解 再加入1 8 NaCl溶液2 0ml校正为等渗溶液 最后加入2 SRBC悬液0 5ml 即为50 溶血悬液 混匀后取此液2 5ml 随试验一起温育 5 取新鲜血清标本 按表CH50试验在各管中加入血清与试剂 一并置于37 水浴箱中温育30min 温育后各管2500r min离心5min 仔细观察比较 选择溶血程度与标准管最为相近的两管 在分光光度计上分别读取OD541值 以最接近标准管OD值的一管定为最高有效反应管 50 溶血总补体值的计算 CH50 U ml 1 血清用量 稀释倍数总补体活性参考范围 50 100U ml 血清总补体50 溶血活性测定 三 方法评价 CH50试验测定经典途径总补体溶血活性 所反应的是补体9种成分的综合水平 方法简便 快速 但敏感性较低 影响因素多 实验时对反应的各个环节应严加控制 统一步骤 补体的溶血活性与试验中反应体积成反比 与反应所用缓冲液的pH 离子强度 钙镁浓度 绵羊红细胞数量和反应温度有一定关系 缓冲液pH和离子强度增高 补体活性下降 Ca2 Mg2 可稳定溶血系统 但过量则反而抑制溶血反应 临床意义 CH50增高见于 急性炎症 组织损伤 恶性肿瘤等 CH50降低见于 系统性红斑狼疮 类风湿性关节炎和强直性脊柱炎 急性肾小球肾炎等 一 概述目前主要测定的补体成分 根据世界卫生组织 WHO 国际免疫学会报告 在30多种补体成分中 主要检测C3 C4 C1q B因子和C1酯酶抑制物 测定方法可分为 溶血法和免疫化学法溶血法 用以检测单个补体成分的溶血活性 免疫化学法 测定补体含量 过去常采用单向琼脂扩散试验或单向火箭免疫电泳目前各检测部门多采用免疫比浊法 随着免疫检测仪器的自动化 速率散射比浊法 ratenephelometry 应用日益广泛 本法可检测包括C3 C4等补体成分在内的20多种血浆中的特种蛋白 是一种快速 敏感和准确的定量检测方法 第三节单个补体成分的测定 常作为单个补体成分的检测指标 C3 C4 C1q B因子和C1酯酶抑制物等 测定方法 免疫溶血法 检测单个补体成分的活性 免疫化学法 检测单个补体成分的含量 自动化免疫散射比浊法 一 免疫溶血法 原理 主要根据抗原与其特异性抗体 IgG IgM型 结合后可激活补体的经典途径 导致细胞溶解 试验的指示系统 该方法中抗原为SRBC 抗体为兔或马抗SRBC的抗体 即溶血素 将两者组合作为指示系统参与反应 参照体系 以人为设计的缺乏某种补体成分的血清为参照 试验中参与的两组补体 一组是作为实验反应系统的补体 选用或制备缺少待测成分的试剂 参照血清常称之 R remove 试剂 加入致敏SRBC 检测经典途径补体成分用 或总红细胞RRBC 检测替代途径补体成分用 指示系统后 此时由于补体不能连续激活 不发生溶血 选用先天缺乏某单一补体成分的动物或人血清 如某些人可天然缺乏C2 豚鼠缺C4 小鼠缺C5 家兔缺C6 利用化学试剂人为灭活正常血清中某种成分制备缺乏该成分的补体试剂 如用氨或肼处理使豚鼠血清C4被破坏 用酵母多糖灭活C3等 另一组为待测血清中的补体 当加入待测血清 使原来缺乏的成分得到补偿 补体成分齐全 级联反应恢复 产生溶血 溶血程度与待测补体成分活性有关 仍以50 溶血为终点 方法学评价 采用免疫溶血法检测待测标本中某一单个补体成分是否缺乏 可以帮助诊断补体某个成分缺失或其含量正常但无溶血活性的失天性补体缺陷 无需特异仪器与设备 快速 但敏感性较低 影响因素多 该法不是检测某补体成分的具体含量 而是检测其活性 在某些需了解该成分活性情况下 本试验适用 免疫溶血法常用于C2 C3 C4 C5 C6等补体成分的检测 其中以C3 C4两成分的检测更为常见 二 免疫化学法 免疫化学法分类1 单向免疫扩散2 火箭免疫电泳3 透射比浊法4 散射比浊法前两种方法 手工操作繁琐 耗时长 影响因素多 结果重复性差 已趋于淘汰后两种方法 通过仪器对补体的C3 C4 B因子等单个成分进行自动化测定 方法评价 手工免疫化学法 单向免疫扩散法与火箭免疫电泳多用手工操作 影响因素多 结果重复性差 现已逐渐趋于淘汰 自动免疫化学法 散射 透射比浊法通过仪器对补体的C3 C4 B因子等单个成分进行测定 待测血清标本的C3 C4成分经适当稀释后与相应抗体结合形成复合物 反应介质中的PEG可使该复合物沉淀 仪器对复合物产生的光散射或透射信号进行自动检测 并换算成所测成分的浓度单位 检测补体成分方法简单 特异 重复性好 可反映所测补体成分的绝对值 并能够进行标准化流程管理 进行质量控制 是目前国内外临床免疫检测中的主要检测方法 第四节补体结合试验 补体结合试验 complementfixationtest CFT 是经典途径的抗原抗体反应之一 凡能激活补体的IgM和IgG类抗体与相应抗原结合的反应均可应用本法检测 目前主要用于病毒性传染病诊断和流行病学调查 以及一些自身抗体 肿瘤相关抗原和HLA血清学分型的检测 一 试验原理 试验的参与反应的成分与系统 5种成分 3个系统 反应系统 已知抗原 或抗体 与待测抗体 或抗原 补体系统 指示系统 SRBC与相应溶血素 试验时常将其预先结合 成为致敏绵羊红细胞 sensitizedsheepredbloodcell SRBCS 试验的二个阶段 第一个阶段 试验中先加入反应系统让其有优先结合的机会 第二阶段 为SRBCS与补体结合的阶段 如果反应系统中存在待测的相应抗体 或抗原 则反应的第一阶段抗原抗体复合物结合补体 此时由于补体已被子结合掉 反应液中已无游离补体 故第二阶段加入指示系统不出现溶血 补体结合试验阳性 如果反应系统中抗原 或抗体 缺乏 或两种不对应 则反应的第一阶段补体游离 与第二阶段加入的指示系统结合出现溶血 补体结合试验阴性 试验中将反应系统的待测抗原 或抗体 作系列倍比稀释可作定量测定 试验中以50 不溶血作为判断终点 补体结合试验示意图 二 试验方法 一 试剂制备1 抗原 用于检测抗体的抗原应以适当方法纯化 以保证试验的特异性 如使用成分复杂的粗制抗原 可通过匀浆和反复冻融 初步提取可溶性抗原 经3000r min离心20min去沉渣 取上清液再经10000r min离心1h 取上清液作抗原 如使用此类粗制抗原 须用经同样处理的正常组织作抗原对照 以排除非特异性反应 2 抗原和抗体的滴定 一般采用方阵滴定法 选择抗原与抗体均呈强阳性反应 100 不溶血 的最高稀释度作为抗原和抗体的效价 或单位 滴定方法 各试管中加入不同稀释度的抗原和抗体及另作不加抗原的抗体对照管和不加抗体的抗原对照管 再依照试验方法加补体和指示系统 经温育后观察溶血反应情况 正式试验中 抗原一般用2 4个单位 1 32 1 16 抗体采用4个单位 1 8 半年左右可复查其效价是否变化 抗原和抗体效价的方阵滴定 注图中可见 1 64的抗原为1个单位 1 32的抗体为1个单位 3 补体的滴定 采用豚鼠血清为补体对补体进行滴定和确定其用量 以能产生完全溶血的最少补体用量为1个实用单位正式试验时使用2个实用单位补体的性质不稳定 每次试验前均应进行滴定 由于该试验基于指示和试验两对抗原抗体系统竞争补体因此 补体必须恒量 且以满足指示系统的溶血为度 过多会导致假阴性 而过少则引起假阳性 补体的滴定 1 60的补体0 12ml可产生完全溶血 此为1个实用单位 按比例公式 0 12 2 60 0 2 X 经计算X 50 即实际应用中的2个实用单位应为1 50稀释的补体0 2ml 二 血清标本 采血并及时分离血清用于检测或 20 保存备用 试验前 应先将血清56 加热30min 或60 3min 以灭活补体 血清标本遇有抗补体现象时 可作下列处理 加热灭活时提高12 20 冻融后离心去沉淀以3mmol L盐酸处理加入少量补体后再行灭活以白陶土处理通入CO2以小白鼠肝粉处理用含10 新鲜鸡蛋清的生理盐水稀释血清 三 正式试验 按补体结合试验操作程序逐步加入各种试剂 温育后先观察各种对照管 且应与预期结果相符 阴性 阳性对照管分别应为明确的溶血与不溶血 抗体或抗原对照管 待检血清对照管 阳性和阴性对照的对照管应完全溶血 SRBC对照管不应出现自发性溶血 补体对照管中2U应全溶 1U全溶或微不溶 0 5U应不溶 若0 5U补体对照管出现明显溶血 表示补体用量过多 如2U不出现完全溶血 则表明补体用量不够 对结果的正确性均有影响 应重复试验 CFT结果 受检血清管不溶血为阳性 溶血为阴性 补体结合试验的操作程序 三 方法学评价 优点 补体结合试验敏感性高 能测定0 05 g ml的抗体 特异性强 由于各反应成分事先经过滴定 比例适当 出现交叉反应的几率较小 反应结果明显 溶血与不溶血易于区分 试验条件要求低 容易普及 不需特殊仪器或只用分光光度计检测溶血反应后的血红蛋白量 应用面广 不同性状的抗原和抗体均可检测 缺点 参与成分多 影响因素复杂 操作繁琐且要求严格 稍有疏忽便影响结果 补体性质不够稳定 难于标准化 且抗原或待检血清可能有抗补体作用 现代化 自动化抗原抗体检测方法的不断涌现 补体结合试验逐渐被遗弃补体结合试验作为一种经典的免疫方法类型 其设计和原理仍对新型