植物转基因育种技术.ppt

1 转基因技术与作物育种 2 转基因育种的概念与优点转基因育种技术的一般操作过程转基因育种技术的应用成果转基因的安全性 3 作物转基因育种就是根据育种目标 从供体生物中分离目的基因 经DNA重组与遗传转化或直接运载进入受体作物 经过筛选获得稳定表达的遗传工程体 并经过田间试验与大田选择育成转基因新品种或种质资源 转基因作物 GMC geneticallymodifiedcrops 第一节植物转基因育种概念及优点 4 与常规育种技术相比 转基因育种在技术上较为复杂 要求也很高 但是具有常规育种所不具备的优势 1 拓宽可利用的基因资源 2 培育高产 优质 高抗优良品种提供了崭新的育种途径 3 可以对植物的目标性状进行定向变异和定向选择 4 可以大大提高选择效率 加快育种进程 此外 还可将植物作为生物反应器生产药物等生物制品 5 Traditionalcrossbreeding RecombinantDNAtechniques 6 第二节植物转基因技术的一般操作过程 7 8 技术路线 目的基因分离 植物表达载体的构建 受体材料的准备 遗传转化 转化组织 组织脱分化 转化植株筛选 炼苗 9 1 目的基因的分离 1 已知基因的获得 化学合成法 PCR扩增 2 未知基因的获得 构建基因组文库 筛选目的基因 构建cDNA文库 筛选目的基因 mRNA差异显示技术筛选差异表达基因 差异蛋白质谱表达技术筛选功能基因 10 pGEM T 银杏叶RNA提取 反转录cDNA chs全长cDNA的克隆 TA克隆及测序 向chs两端引入酶切位点 双酶切 定向克隆 导入农杆菌 2 植物表达载体的构建 11 3 受体材料的准备 细胞的全能性 分化细胞脱分化再分化 12 4 遗传转化 1 间接转化法 农杆菌介导转化法 2 直接转化法A 基因枪转化法B 电击法C 花粉管通道法D PEG介导基因转化法 13 根癌农杆菌 Agrobacteriumtumefaciens 是一种革兰氏阴性土壤杆菌 它含有Ti质粒 能诱导被侵染的植物细胞形成肿瘤 即诱发冠瘿瘤 Ti质粒 包括Ri质粒 上有一段转移DNA 在农杆菌侵染宿主植物时 这段DNA可以转移进植物细胞 并稳定地保留在植物细胞染色体中 变为植物细胞新增加的一群基因 最终能通过有性世代遗传给子代 返回 14 基因枪转化法由美国Cornell大学的Sanfor 1987 提出 它的主要原理是将包含目的基因的载体包被在微小的金属微粒 钨粒或金粒 表面 通过高压驱动力加速微粒穿透植物细胞壁 导入受体组织细胞内 然后通过组织培养再生出完整的植株 微粒上的外源DNA进入细胞后 整合到染色体上并得到表达 从而实现基因的转化 返回 15 电击法的主要原理是将原生质体在溶液中与DNA混合 然后利用高压电脉冲作用 使原生质体膜的某些部位被击穿而产生可回复的小孔 外源DNA可通过小孔进入原生质体内 而且不影响经电击处理的原生质体再生植物的能力 返回 16 花粉管通道法是利用开花植物授粉后形成的花粉管通道 直接将外源目的基因导入尚不具备正常细胞壁的卵 合子或早期胚胎细胞 实现目的基因转化 返回 17 PEG介导基因转化的主要原理是聚乙二醇 PEG 多聚 L 鸟核苷酸 pLO 磷酸钙及高pH值条件下诱导原生质体摄取外源DNA分子 PEG可促使细胞膜与DNA间接触与粘连 并通过引起膜表面电荷的紊乱及干扰细胞间的识别 利于细胞膜间的融合以及外源DNA进入原生质体 返回 18 表1几种植物转基因方法比较 19 5 转化组织 农杆菌介导之叶盘转化法 带有转化基因的农杆菌活化 受体植物 叶盘 侵染 共培养 筛选培养 诱导成苗 20 21 22 6 炼苗 23 一 转基因技术的发展现状 第三节作物的转基因技术的应用成果 自从1983年第一株转基因烟草获得以来 至今已有120种植物转基因获得成功 1996年全球大面积种植 并不断扩大 国际农业生物技术应用服务局 ISAAA 统计结果 24 世界银行下属机构预测 世界范围内转基因作物产业的交易额 2010年达到200亿美元 1500万农民种植转基因作物种植国家先后有30多个国家批准了3000多例田间试验 涉及的植物种类有40多种 2000年有13个国家种植商品化转基因植物 2004年有17个国家种植商品化转基因植物 25 在2008年 转基因作物种植国的数量激增到了25个 其中 种植面积排名前三位的国家分别为 美国 6250万公顷 阿根廷 2100万公顷 和巴西 1580万公顷 中国全国生物技术作物种植面积达380万公顷 在全球生物技术作物种植面积超过100万公顷的八个国家中排名第六 欧洲很少与世界上其他商业化种植Bt玉米的国家相比 欧盟的种植规模很小 2008年大约10万公顷Bt玉米在欧盟国家被种植 与美国相比 欧盟的转基因安全管理法规和制度仍然是非常严格的 26 美国 3900万公顷加拿大 350万公顷阿根廷 1350万公顷中国 210万公顷 27 转基因作物种类主要为大豆 玉米 棉花和油菜等 以转基因大豆面积最大 目标性状抗除草剂 2000年使用抗除草剂大豆 玉米和棉花占转基因作物74 抗虫和抗病毒病 2000年 Bt玉米 Bt棉花占19 耐除草剂 抗虫性双价的转基因棉花和玉米占7 28 美国三大转基因作物历年种植面积 29 Firstbiotechplantproduct Flav rSav rtomato 30 我国转基因作物研究与利用概况我国是世界上第一个商品化种植转基因作物的国家 自行培育的双价转基因烟草的抗病虫性达到60 产量比对照增加15 产值增加20 1992年每亩增收200元 遗憾的是由于市场的原因现已不推广 到1999年我国已批准中试的转基因作物有48项 包括水稻 小麦 玉米 番茄 白菜 番木瓜 甜瓜 花生 棉花 烟草 广藿香等11种作物 主要目标性状是抗虫 抗病 耐盐 抗冻 耐储藏和抗衰老等 已批准环境释放的有49个品种 涉及水稻 玉米 大豆 马铃薯 番茄 甜椒 线辣椒 棉花 杨树 烟草等10种作物 31 经全国基因工程安全委员会批准商品化生产的作物已有 我国自行研制开发的抗虫转基因棉花 转Bt及Bt CpTI双价抗虫棉 2004年种植转基因棉花370万公顷 占棉花种植面积的50 美国Monsanto公司开发的Bt抗虫棉 延迟成熟期的转基因番茄 抗黄瓜花叶病毒 CMV 转基因番茄 抗CMV转基因甜椒 转查尔酮合酶 CHS 反义RNA基因矮牵牛 32 由中国农科院生物工程中心开发的Bt棉对棉铃虫有显著的抗性 与对照相比减少农药用量80 并减少用工150个 hm2 以上两者可使每公顷节省1500元 Bt转基因棉种深受棉农的欢迎 33 第四节转基因作物的生物安全性 34 直至今天 转基因作物的安全性在全球范围内引起了激烈的争论 反对者认为转基因作物具有极大的潜在危险 可能会对人类健康和人类生存环境造成威胁 在欧洲 转基因作物被一些媒体称之为 恶魔食品 frankensteinfood Frankenstein是英国科幻小说中由一个科学家创造 最终又毁灭了这个科学家的怪物 那么 人类研制与种植转基因作物到底是毁灭自己 还是拯救自己呢 35 对转基因作物的安全性争论 国际上有几个典型的事件 Pusztai事件 英国Rowett研究所有位Pusztai博士 他用转雪花莲凝集素基因的土豆喂大鼠 1998年秋天在英国电视台发表讲话 声称大鼠食用了这种土豆后 体重和器官重量减轻 免疫系统受到了破坏 后果 绿色和平组织 地球之友等反生物技术组织把这种土豆说成 杀手 并策划了破坏转基因作物试验地等行动 焚烧了印度的两块试验田 甚至美国加州大学戴维斯分校的非转基因试验材料也遭破坏 以致研究生毕业论文都无法如期完成 英国皇家学会组织了同行评审 并于1999年 月发表评论 指出Pusztai的试验有六方面的错误 不能确定转基因和非转基因马铃薯的化学成分有差异 对食用转基因土豆的大鼠 未补充蛋白质以防止饥饿 供试动物数量少 饲喂几种不同的食物 且都不是大鼠的标准食物 缺少统计学意义 试验设计差 统计方法不当 试验结果无一致性等 36 斑蝶事件 1999年5月 康奈尔大学的一个研究组在 Nature 杂志上发表文章 声称转基因抗虫玉米的花粉飘到一种名叫 马利筋 的杂草上 用马利筋叶片饲喂美国大斑蝶 导致44 的幼虫死亡 这一实验结果在科学上没有说服力 玉米的花粉非常重 扩散不远 在玉米地以外 米 马利筋叶片 CM2上只找到一个玉米花粉 2000年开始在美国三个州和加拿大进行的田间试验都证明 抗虫玉米花粉对斑蝶并不构成威胁 实验室试验中用 倍于田间的花粉量来喂大斑蝶的幼虫 也没有发现对其生长发育有影响 斑蝶减少的真正原因 一是农药的过度使用 二是墨西哥生态环境的破坏 37 加拿大 超级杂草 事件 由于基因漂流 在加拿大油菜地里发现了个别油菜植株可以抗一种 两种或三种除草剂 因而有人称此为 超级杂草 并怪罪于转基因 基因漂流并不是从转基因作物开始 如果没有基因漂流 就不会有进化 世界上也就不会有这么多种的植物和现在的作物栽培品种 举例来说 小麦由 三个基因组组成 它是由分别带有 基因组的野生种经过基因漂流合成的 所以 以此来禁止转基因作物 也是没有道理的 38 中国 t抗虫棉破坏环境事件 2002年6月3日 南京环科所与绿色和平组织在北京召开会议 月 日 Chinadaily 上发表了题为 GMCottonDamageEnviroment 的文章 当天 绿色和平组织在其网站上刊登了南京环科所 绿色和平组织顾问薛达元先生长达26页的英文报告 从而再次引发国际争论 在欧 美产生巨大反响 月 日德国 农业报 发表了题为 中国研究 棉破坏环境巨大 绿色和平组织的 中国项目主管 声称 棉农将面对不受控制的超级害虫 转基因抗虫棉不但没有解决问题 反而制造了更多的问题 棉农将被迫使用更多 更毒的农药 事实上 抗虫棉在中国实践多年 深受广大棉农的欢迎 中国 美国 德国 加拿大 比利时 印度等国的科学家已在网上纷纷发表评论 反驳绿色和平组织的观点 39 争论的实质现在转基因作物的安全性已经成了国际贸易的技术壁垒 由于某些媒体的炒作 对消费者的心理和转基因作物的产业化已经产生了很大的负面影响 我们的判断 40 我们所要了解的 转基因植物的潜在风险 1 转基因植物释放引发 超级杂草 目前转入植物的基因以抗除草剂的为多 其次以抗虫和抗病毒 然后是抗逆 如果这些基因逐渐在野生种群中定居后 就具有选择优势的潜在可能 成为难以控制的 超级杂草 41 2 转基因植物中35S启动子的生物安全性启动子是基因表达所必需的 决定了外源基因表达空间 表达时间和表达强度等 是人们定向改造生物的重要限制因素 最常用的启动子是35S启动子 该启动子能够在植物组织中高水平表达 因此已经被引入许多转基因植物中 潜在风险问题 35S启动子内有一重组热点 1 如果35S启动子插入到隐性病毒基因组旁 可能会重新活化病毒 2 启动子插入到某一编码毒素蛋白的基因上游 可能会增强该毒素的合成 3 当转基因植物被动物或人类食用后 35S启动子可能会插入到某一致癌基因上游 活化并且导致癌变 42 3 抗生素抗性标记基因的生物安全性抗生素抗性标记基因是否导致的在环境中的传播 目前 转基因作物都使用细菌编码的抗生素抗性基因作为选择性标记 在过去的几年里 越来越多的报道指出 细菌可以获得对多种抗生素的抗性 这导致人们开始怀疑 转基因植物中的抗性基因是否会转移到细菌中 抗性标记基因是否会通过食物在肠道中水平转移至体内微生物 从而影响抗生素治疗的有效性 抗性标记基因产物是否使人体产生抗药性 食品安全性 43 4 转基因食品的安全性1994年美国Caigene公司的转基因延熟番茄经FDA批准上市 成为第一例通过安全评价的转基因植物食品 转基因食品对人类的可能危害主要有3大类 1 可能含有已知或未知的毒素 对人体产生毒害作用 2 可能含有已知或未知的过敏源 引起人体的过敏反应 3 食品某些营养成分或营养质量可能产生变化 使人体出现某种病症 44 国外对转基因食品管理的现状 1 国际组织实质等同原则表型性状的等同成分等同2000年 卡塔赫纳生物安全协定书 62个国家签署2001年 生物安全议定书 130多个国家签署2003年 生物技术食品的风险评估草案 226个国家表示欢迎 45 2 美国 1992年美国公布了转基因作物不需由作市场前评价 除非它引起新的安全性问题 2000年4月 在国会科学委员会下属的基础研究委员会的调查报告中 坚持认为没有科学的证据之前不能将GMF作为一个新的食品级别 2000年1月美国政府对转基因玉米的种植颁布了限令 以防止害虫对转基因玉米中毒素形成抗药性 美国环境保护局限令美国大部分玉米产区的农场主应至少种植20 的传统玉米 在同时种植玉米和棉花的地区 传统玉米要达到50 2001年7月出台了 转基因食品管理草案 规定 来源于植物且被用于人类或动物的GMF在进入市场之前至少120天 生物工程制造商必须提出申请 并提供此类食品的相关资料 以确认此类食品与相应的传统产品相比具有等同的安全性 46 3 欧盟 欧盟对GMF持反对态度 1998年提出转基因技术安全性之后 其反对态度更加强硬 他们对转基因技术培育的农作物 家畜以及再加工食品加以抵制 尤其对美国的转基因玉米已终止了进口 然而对于西班牙和德国的转基因玉米却没有采取措施 欧盟的法律由两项 欧盟理事会90 220令 于1990年4月颁布实施 该法令中规定了转基因生物的批准程序 1997年5月 新食品法 规定对转基因产品必须加贴标签 47 4 其它国家 日本 澳大利亚 俄罗斯 加拿大 韩国 泰国 巴西的政策基本与国际组织的相同 但是巴西最近宣布在未查清转基因作物对环境的影响之前 暂时停止种植转基因大豆 发展中国家迫切需要解决粮食问题 对于高产的转基因产品表示欢迎 这些国家技术落后 没有相关的转基因成分的检测条件 对于标识问题也只能处于被动地位 基本是按国际组织的要求和 生物安全议定书 要求执行 48 我国对转基因食品的对策 1993年12月24日 国家科委颁布实施了 基因工程安全管理办法 1996年7月10日 国家农业部颁布实施了 农业生物基因工程安全管理实施办法 2001年6月6日国务院颁布了 农业转基因生物安全管理条例 2002年4月8日国家卫生部颁布了 转基因食品卫生管理办法 49 由于转基因产品存在一定的风险 如转基因产品本身对人类的毒害作用 转基因作物对环境的破坏性作用 包括转入的外源基因在环境中的扩散 对物种多样性的影响等 因此必须从保障人类健康 发展农业生产和维护生态平衡与社会安全的基础出发 提出一系列具有指导意义的对应策略和行之有效的具体措施 具体建议如下 1 加强转基因产品的安全性研究 在研究与开发转基因产品的同时 必须加强