硫酸盐还原菌对重金属离子的吸附

目目 录录 中文摘要 3 英文摘要 4 第一章 绪 论 5 1 1 研究背景 5 1 2 胞外聚合物的定义和作用 6 1 3 胞外聚合物的成分和含量 6 1 4 EPS 在废水处理中的作用 7 1 5 胞外聚合物研究进展及前景展望 7 第二章 胞外聚合物对金属离子的吸附 8 2 1 概述 8 2 2 吸附机理 9 2 2 1 离子交换机理 9 2 2 2 氧化还原机理 10 2 2 3 表面络合机理 10 2 2 4 酶促机理 11 2 3 影响吸附的因素 11 2 3 1 吸附时间 12 2 3 2 pH 值的影响 12 2 3 3 温度的影响 13 2 3 4 EPS 用量对吸附的影响 13 2 3 5 金属离子初始浓度的影响 13 2 3 6 共存离子的影响 13 第三章 材料与方法 15 3 1 硫酸盐还原菌的培养 15 3 2 胞外聚合物的提取及分析 15 3 2 1 胞外聚合物的提取方法比较 15 3 2 2 提取方法评价指标 16 3 2 3 胞外聚合物的提取 17 3 2 4 胞外聚合物的分析 18 3 3 金属溶液的准备 20 3 4 吸附实验过程 20 3 4 1 最佳吸附时间确定 20 3 4 2 最佳 pH 的确定 20 3 4 3 吸附等温线绘制 21 3 4 4 Cu2 与 Zn2 的竞争吸附 22 3 5 傅里叶红外线光谱 22 第四章 结果与讨论 24 4 1 胞外聚合物的特点 24 4 2 接触时间对 Cu2 与 Zn2 吸附的影响 24 4 3 溶液的 pH 对 Cu2 和 Zn2 吸附的影响 25 4 4 Cu2 和 Zn2 的吸附等温线模型 26 4 5 Cu2 和 Zn2 在胞外聚合物上的竞争吸附 29 4 6 吸附前后的胞外聚合物的红外光谱分析 30 结 论 32 致 谢 33 参考文献 34 硫酸盐还原菌硫酸盐还原菌 EPS 对重金属离子吸附性能研究对重金属离子吸附性能研究 摘要 胞外聚合物 Extacellular Polymeric Substances EPS 是一定环境条件下 由细菌 真菌 藻类细胞分泌的高分子聚合物 对重金属具有良好的吸附 效果 胞外聚合体覆盖在微生物的表面 填充在各种微生物聚集体内部空 隙中 维持各种微生物聚集体的结构和功能的完整性 是决定其表面性质 的关键物质 用从硫酸盐还原菌中提取的 EPS 吸附 Cu2 和 Zn2 研究接 触时间 溶液初始 pH 对吸附的影响 得出吸附在 12 小时达到平衡 吸附 量随着 pH 的升高而升高 绘制 Cu2 和 Zn2 的吸附等温线 Freundlich 和 Langmuir 吸附模式都可以充分的描述硫酸盐还原菌 EPS 对 Cu2 和 Zn2 的 吸附 从 Langmuir 模式中得出硫酸盐还原菌 EPS 对 Cu2 和 Zn2 的最大吸 附量分别为 899 068mg g EPS 和 603 5mg g EPS 研究 Cu2 和 Zn2 对 EPS 的竞争吸附 二元金属吸附实验表明对金属离子的亲和性为 Zn2 Cu2 FTIR 分析揭示羧基 胺基和羟基在吸附 Cu2 和 Zn2 中起主要作用 关键词 胞外聚合物 生物吸附 硫酸盐还原菌 重金属 Abstract Extacellular polymeric substances EPS produced by many microorganisms such as algae bacteria and fungi play a crucial role in the biosorption of heavy metals EPS on the microbial cell surface are a major component of microbial aggregates for keeping them together in a three dimensional matrix They are a key element for governing the microbial surface characteristics Sorption of Cu2 and Zn2 onto the extracellular polymeric substances EPS produced by Sulfate reducing bacteria SRB was investigated for the contact time and the initial pH of the solution The results showed that the adsorption of balance was arrived at 12 hours and the sorption of Cu2 and Zn2 increased with increasing pH Then we draw the adsorption isotherm of Cu2 and Zn2 Both the Freundlich and Langmuir adsorption models described the sorption of Cu2 and Zn2 by the EPS of Sulfate reducing bacteria The maximum sorption capacities of Sulfate reducing bacteria EPS calculated from the Langmuir model were 899 068mg g EPS and 603 5mg g EPS for Cu2 and Zn2 respectively We study the Cu2 and Zn2 on the competitive adsorption of EPS The binary metal sorption experiments showed a selective metal binding affinity in the order of Zn2 Cu2 Fourier transform infrared spectroscopy FTIR analysis revealed that carboxyl and hydroxyl functional groups were mainly correlated with the sorption of Cu2 and Zn2 Keywords Extacellular polymeric substances Biosorption Sulfate reducing bacteria Heavy metal 第一章 绪 论 1 1 研究背景 随着工业生产的不断发展 排放到环境中的含重金属离子的废水不论是从 数量上还是从种类上都大大的增加了 重金属污染于其它有机化合物的污染不 同 重金属具有亲脂性 高复积性和难降解性 进入水体后容易在水生生物体 内积累 并随着生物营养级的升高而增大 水体中的重金属还能对生物产生显 著毒性作用 所以 即使很低的重金属浓度都会对水生生态系统和人类造成严 重危害 重金属污染已成为世界范围的严重环境问题 我国水体重金属问题也 十分突出 根据全国 906 个供水水源地的底质断面监测结果 受重金属污染的 断面有 732 个 污染率为 81 其中超标断面有 332 个 超标率为 37 1 水体 的重金属污染已成为不争的事实 水环境重金属污染不但造成了重大的经济损 失 还对水生生态系统平衡及人类生命健康都带来了极大的破坏 因此 有效 的去除废水中的重金属已成为环保领域十分迫切的任务 传统的处理方法包括化学沉淀法 化学氧化还原法 离子交换法 膜处理 法和电化学法等 但这些方法存在投资大 运行成本高 操作管理麻烦 并且 会产生二次污染和不能很好地解决金属和水资源再利用的问题 很大程度上限 制了它们的实际应用价值 近年来 一种崭新的处理含金属废水的方法 生 物吸附法以其高效 廉价的优点逐渐引起了人们的兴趣 所谓生物吸附法就是 利用某些生物体本身的化学结构及成分特性来吸附溶于水中的金属离子 再通 过固液两相分离来去除水溶液中金属离子的方法 它具有原料价廉易得 吸附 设备简单 易操作 吸附速度快 吸附量大 选择性好等特点 而胞外聚合物 Extracellular Polymeric Substances EPS 作为一种新型的生物吸附剂已经越来 越受到国内外众多学者的重视 胞外聚合物是一定环境条件下由细菌 真菌 藻类细胞分泌的高分子聚合物 主要成分包括多糖 蛋白质 腐殖质 糖醛酸 核酸和脂类等 这些组分中含有 COOH NH2 SH OH和PO43 等官能团 2 这些官能团中的氮 氧 硫等原子都可以提供孤对电子与金属离子配位 因此 对重金属有很强的吸附作用 3 研究表明 微生物胞外聚合物 EPS 对重金属 具有良好的吸附效能 在生物吸附中起重要作用 作为一种无生命无代谢的生 物吸附剂 微生物胞外聚合物因易得 在处理过程中不需营养物质 可避免与 微生物相关的致病原等而更具优势 1 2 胞外聚合物的定义和作用 胞外聚合物通常认为是微生物细胞外高分子物质的总称 这些高分子物质 主要来源于细胞内分泌 细胞表面物质脱落 细胞自溶和外界吸收等不同过程 在早期研究中 胞外聚合物常被称为 extracellular polysaccarides exopolysaccarides exopolymers extracellular polymer ECP extracellular material 等 这是因为多糖 Polysaccarides 在早期的生物膜研究中曾被认为是 EPS 的主要成分 然而 随着研究的深入 人们发现蛋白质 核酸以及一些脂 类物质在活性污泥 下水道生物膜 滴滤池生物膜以及一些纯培养微生物的胞 外聚合物中也占了很重要的比重 甚至占据了绝对数量 此外 腐殖质也在一 些土壤微生物的胞外聚合物中发现 因此 extracellular po1ymeric substances 就 成为一个更普遍 更能全面概括微生物胞外聚合物的一个名称 简称 EPS 4 EPS 对于微生物的作用很多 较为突出的作用有以下几点 1 吸附周围环境中的有机物及无机离子 并在重金属生物吸附中发挥关 键作用 2 在细胞外形成保护层 阻止有害外源物质对细胞的毒害作用 3 为饥饿环境中的细胞提供碳源和能量 4 粘附在细胞表面 聚合细胞 固定基质 5 酶活动 消化外界大分子物质以满足营养需求 1 3 胞外聚合物的成分和含量 分析 EPS 的化学组成是是 EPS 研究的基础 是理解整个废水处理反应器 中 微生物表面特性的前提 在活性污泥中 EPS 的含量最高可占污泥干重的 15 或更多 EPS 的主要有机成分是多糖和蛋白质 二者的含量比 以重量计蛋白 质 多糖 约在 0 2 5 之间 此外还有磷脂 核酸 腐殖质 糖醛酸以及无机成 分 5 其中蛋白和多糖占 EPS 总量的约 70 80 其他部分占 20 30 对废水 生物处理反应器中污泥来说 腐殖质可能也是其中一个主要的成分 含量约为 20 6 研究者还对 EPS 中多糖和蛋白质的单体成分进行了分析 7 胞外多糖 所含的单糖种类较多 主要有鼠李糖 甘露糖 半乳糖 葡萄糖 氨基葡萄糖 等 胞外蛋白含有的氨基酸种类有天冬氨酸 甘氨酸 丙氨酸 丝氨酸 亮氨 酸 赖氨酸等 1 4 EPS 在废水处理中的作用 EPS 与废水处理反应器中微生物聚集体的结构 组成 表面性质以及微生 物生态均密切相关 在废水生物处理中起着重要作用 EPS 基质和微生物细胞 通过各种作用力粘结在一起 形成一个巨大的网状结构 含有大量的水份 可 以防止微生物缺水干燥 由于 EPS 和细胞之间存在范德华相互作用 静电相互 作用 氢键 疏水相互作用等 EPS 在微生物聚集 絮凝 自固定成生物膜或 颗粒等方面起了很大的作用 可加速微生物聚集体的形成 保护细菌免受外界 不利环境的影响 8 在营养不足的情况下可用作碳源或能源 协助细胞摄入附 近的营养物 从外界环境中吸取和积累营养物质 EPS 表面含有大量的可以和 金属离子发生相互作用的官能团 如羧基 羟基等 可以和金属离子发生吸附 或螯合 可以有效的去除废水中含有的金属或重金属离子等等 1 5 胞外聚合物研究进展及前景展望 鉴于 EPS 在废水生物处理系统中起着极其重要的作用 EPS 吸引了越来 越多的研究者关注 目前对 EPS 的研究多集中在 EPS 提取 性质表征 EPS 与微生物特性关系这几方面 未来随着人们对胞外聚合物及其主要成分的认知 开发和利用细菌胞外聚 合物及其主要成分的研究将成为热点 细菌胞外聚合物及其主要成分的理论研 究 对于揭示生命活动的奥秘有着重要而深远的意义 今后胞外聚合物及其主 要成分的在矿物加工 冶金 环境 食品 生物医学 石油等工程上研究和应 用的重点有以下几点 1 大批量培养合适的菌株 以获得 EPS 2 利用基因技术培育合适的菌株 以获得大量的 EPS 3 测定 EPS 的结构 4 研究 EPS 结构与其抑制作用之间的相互关系 5 针对不同工程需要 有针对性的开发胞外聚合物的特性 6 研究胞外聚合物在生物互作与信息传递方面的作用 第二章 胞外聚合物对金属离子的吸附 2 1 概述 近年来 全世界金属消耗量量总的里上升趋势 所以相应的金属废物也在 增加 在工业生产中 金属极板制造 金属催化剂生产 制革鞣革 颜料与染 料工艺 熔解工艺 家电生产 汽车外壳的磷化过程都是产生金属 重金属离 子有机废水 废物的主要来源 由予这类废水中不但含有有机污染物 还会有 多种重金属离子 所以一旦排到自然环境中 将严重危及人类和许多动 植物 的正常生存 为此世界环保组织 入类健康保护组织重新规定了大气 食品及 饮粥水中金属离子的浓度极限 有效去除废水中金属 重金满离予的呼声也越 来越高 胞外聚合物中存在大量的阴离子基团 这些基团使胞外聚合物可以与金属 离子发生相互作用 选择性的从环境中结合重金属 多种微生物产生的 EPS 由于能够絮凝和键合溶液中的金属离子而与生物修复过程紧密相关 己有的研 究表明 活的生物体和非活性的胞外聚合物都具有较强的生物吸附性能 两者 相比 活的生物体具有更大的应用局限性 因为进行代谢活动需要供给营养成 分 消耗水中氧使得生物耗氧量 BOD 和化学耗氧量 COD 增加 活细胞吸 附过程中有一部分重金属通过代谢进入细胞内 使得金属回收难度增大 而胞 外聚合物不进行代谢活动 则无以上缺点 而且可避免与微生物相关的致病原 所以 生物聚合物作吸附剂更具有经济性 高效性和安全性 9 在负电性的胞外聚合物中 金属离子可以起到架桥的作用 一般而言 细 菌生物聚合物的金属键合是通过与负电官能团 糖醛酸 与膜组分相关的磷酸 基或与氨基酸相连的羧基 的静电相互作用来完成的 此外 阴离子聚合物或 羟基等也可协同此作用 有关胞外聚合物吸附重金属的研究一直在进行 并取 得了很多进展 Brown 等 10 在研究活性污泥对重金属的去除作用时发现重金属 的去除是通过污泥的絮凝和沉淀实现的 而细菌 EPS 在絮凝过程中起着重要作 用 并提出了细菌 EPS 去除重金属的几种可能机理 Chen 等 11 研究了 13 种细 菌 EPS 对 Pb2 Cd2 的吸附 发现所有的 EPS 都使 Pb2 Cd2 的线性分配系数 减小 田禹等 12 的研究表明活性污泥胞外聚合物对 Zn2 的吸附稳定性 吸附能 力和亲和力均比对 Cd2 的吸附强 潘响亮等 13 14 研究了硫酸盐还原菌混合菌 EPS 对 Cu2 和 Zn2 吸附能力 张道勇等 15 研究了细菌生物膜所分泌的胞外聚合 物 EPS 对金属 Cd2 的去除作用 在胞钋聚合物对重金属离子吸附研究这个课题上 国内科研人员的研究主 要 集中在胞外聚合物对重金属离子吸附机理的探索 胞外聚合物的空间结构和组 成 在较大程度上决定了对重金属离子的吸附效率 国外研究热点主要集中在胞外 聚 含物作为吸附剂的应用上 研究表明胞外聚合物对不同种类重金属离子的吸附 作 用不同 具有一定的吸附顺序 普遍研究结果认为胞外聚合物对金属离予吸附 能 力顺序为 Zn2 Cu2 Cr3 Cd2 Co2 Ni2 CrO42 胞外聚合物对 Cu2 Zn2 Pb2 和 Cd2 有强烈的吸附作用 对 Co3 Ni2 和 CrO42 吸附作用较 弱 其中 Ni2 Cu2 Cd2 和 CrO42 的吸附等温线与 Freundilich 方程拟合良好 而 Zn2 Cd2 Ni2 和 Pb2 的吸附等温线与 Langmuir 方程拟合良好 2 2 吸附机理 根据生物吸附金属是否依赖细胞的代谢 把生物吸附机理分为代谢依赖的 和非代谢依赖的 而根据从溶液中去除的金属定位 把生物吸附分为胞外聚集 或沉淀 细胞表面吸附或沉淀和胞内聚集 但由于生物吸附剂的多样性及其结 构的复杂性 以及金属溶液组成的复杂性 生物物质吸附金属的机理十分复杂 近些年 国内外很多学者对生物吸附机理提出了各种各样的观点 归结起来 吸附机理主要有表面络合 离子交换 氧化还原 无机微沉淀 酶促机理和静 电作用 由于生物成分的多样性 生物吸附的机理取决于生物吸附剂种类特性 另外 金属的生物吸附是以许多金属结合机理为基础的 这些机理可以是单独 起作用的 也可以与其它机理结合在一起起作用 这取决于过程的条件和环境 2 2 1 离子交换机理 借助于固体离子交换剂中的离子与稀溶液中的离子进行交换 以达到提取或去除溶液 中某些离子的目的 是一种属于传质分离过程的单元操作 离子交换是可逆的等当量交换 反应 吸附在离子交换剂上的蛋白质可以通过改变 pH 使吸附的蛋白质失去电荷而达到解 离但更多的是通过增加离子强度 使加入的离子与蛋白质竞争离子交换剂上的电荷位置 使吸附的蛋白质与离子交换剂解开 18 不同蛋白质与离子交换剂之间形成电键数目不同 即亲和力大小有差异 因此只要选择适当的洗脱条件便可将混合物中的组分逐个洗脱下来 达到分离纯化的目的 Matheickal 和 Yu 19 还发现从藻类生物体释放出的钙 镁和 氢离子的总量与被吸附的金属离子之间存在等当量关系 进一步验证了离子交 换机理的存在 Brady 等 20 研究了非活性少根根霉对 Sr2 Mn2 Zn2 Cd2 Cu2 和 Pb2 的吸附 也发现 Ca2 Mg2 H 从生物量 上被交换下来进入溶液 金属离子的吸附量越大 释出的 Ca2 Mg2 H 的总 量也越大 然而这些交换下来的离子总量与金属离子的总吸附量相比只是很小 的一部分 说明离子交换并非主要吸附机理 郑蕾 21 利用 X 射线荧光衍射 XRF 分析了吸附重金属前后元素含量的变化 结果表明 EPS 吸附 Pb2 Zn2 Cd2 后 K Na Ca Mg 这几种元素的含量均下降了 且离子交换 对 Pb2 的作用比另外两种金属更大 2 2 2 氧化还原机理 变价金属离子在具有还原能力的生物体上吸附 有可能发生氧化还原反应 如 小球藻 Chlorella vulgaris 对 Au3 离子具有很强的吸附能力 光谱实验证实 在吸附金的细胞上有元素金的存在 在用适当的洗脱液解吸后 只有 Au1 离子 从细胞上脱附 这表明在吸附过程中 Au3 首先被还原为 Au1 然后又被还原 为单质金 22 有人从有机物改良和经 Cr6 驯化的土壤中分离出来 20 种抗 Cr6 细菌 培养基中发现有 9 种细菌能自动地把 Cr6 还原成 Cr3 从 Cr6 污染的土 壤中获得的链母菌 Streptomycessp 3M 在葡萄糖或 NADH 存在的条件下可以还 原 250 mg L Cr6 值得注意的是还原的 Cr 主要存在于介质中 生成不溶性 Cr OH 3 研究 Fe2 在海藻 Sargassumfluitans 上的吸附机理 经 X 射线光电子能 谱对吸附 Fe2 和 Fe3 后的海藻材料进行分析得知 在吸附过程中 部分 Fe2 被 氧化成 Fe3 2 2 3 表面络合机理 通常微生物的细胞表面主要由多聚糖 蛋白质和脂类组成 这些组成中可 与金属相结合的主要官能团有羧基 磷酰基 羟基 硫酸脂基 氨基等 其中氮 氧 磷 硫作为配位原子与金属离子配位络合 红外光谱技术已广泛应用于研 究金属在细胞上的吸附行为 通过比较生物体吸附金属离子前后的光谱变化来 探讨其吸附机理 经 X 射线吸收精细光谱分析可知 在 2 6 10 3 0 15 mmol g 的吸附量范围内 锌离子主要以四面体构型配位到 4 个磷酰基上 当锌离子浓 度达到饱和状态时 小部分锌离子与羧基形成络合物 16 研究者用大量具有不 同强度的金属结合点的模型解释了 EPS 去除重金属的结果 这种模型与高分子 量的胞外聚合物具有大量的功能基团有关 金属首先占据高绑定能量点结构 然后当溶液金属浓度上升后 再占据弱能量点 采用不同的仪器分析技术 在 分子水平上对 Fe2 和 Fe3 在海藻 Sargassum fluitans 上的吸附机理开展了研究 经过对这种生物体进行脂化反应后 应用电位滴定法测得了不同脂化产物中羧 基的含量 并测定了各产物对金属离子的吸附容量 研究发现 脂化产物中羧 基含量与金属吸附容量存在良好的线性关系 张道勇等在研究 EPS 在菌藻生物 膜去除污水中镉的作用时发现 生物膜去除镉的效率与菌藻生物膜 EPS 的含量 几乎是线性相关 潘响亮等 15 利用红外光谱分析硫酸盐还原菌混合菌群的 EPS 对 Zn2 的吸附机理发现 EPS 吸附 Zn2 起主要作用的官能团是多聚糖 C O C 羧基和脂类官能团 蛋白质和多聚糖的 OH 对 Zn2 的结合能力有限 而潘响亮 等 14 的另一研究发现 EPS 对 Cu2 的吸附主要在于 EPS 中蛋白质的酰胺 羧基 多聚糖的 C O C OH 和脂类等基团对 Cu2 的强络合能力 Tobin 17 在研究中 发现碱金属离子不被微生物所吸附 这从另一方面证实了生物细胞与金属离子 的结合的确是与某些含 N P S 等配位原子的特殊官能团有关 2 2 4 酶促机理 在无酶催化的情况下 底物需要越过一个较高的活化能才能发生反应 变 成产物 酶作为催化剂所起的作用就是降低活化能 从而使反应速度加快 酶 为什么会降低酶促反应活化能屏障 现在一般认为 从底物角度来说 当底物 进入酶活性中心区域得到集中 浓缩后 由于酶与底物的相互作用 致使两者 的构象都发生了变化 此时底物分子内某些基团电子密度发生了变化 形成所 谓电子张力 使与之相连的敏感键一端变得更加敏感 更易断裂 稳定的酶 底 物共价中间物 此中间物很容易变成过渡态 使反应活化能大为降低 这样底 物就可以越过较低活化能屏障形成产物 同时酶和底物的相互作用时要释放一 些结合能 以使酶 底物复合物稳定 同时可用来降低化学反应所需的活化能了 非活性和活性的生物都能吸附重金属 活性生物细胞对金属的吸附与细胞上 某种酶的活性有关 用活性啤酒酵母吸附 Cd2 分析得知 Cd2 是以磷酸盐的形 式沉淀下来 且酵母细胞的细胞壁上没有镉的磷酸盐沉淀物 而细胞内的液泡 中有大量的镉沉淀物 认为是细胞中磷酸酶将 Cd2 运输进入细胞 Blackwell 等 24 也报道了啤酒酵母内积累的 Sr2 Mn2 Zn2 分别有 70 90 60 在液 泡内 其余的存在于细胞质或细胞膜上 所以液泡是胞内金属积累的主要场所 这种磷酸酶是通过在细胞培养过程中引入一种 磷酸供体 而产生的 2 3 影响吸附的因素 对 EPS 去除重金属的影响因素目前认为主要包括 pH 值 金属离子的初 始浓度 离子强度 温度 表面特性 金属种类 EPS 的组成和投加量等 研 究 EPS 吸附的影响因素可以找到最佳的吸附条件 从而可以达到对金属离子的 最佳吸附效果 现简单介绍以下主要影响因素 2 3 1 吸附时间 吸附时间是影响重金属吸附的主要因素 生物吸附剂达到其平衡吸附量都 有一个最佳吸附时间 尽管很多吸附都是快速吸附 时间太短不能达到较好的 吸附效果 时间太长又可能发生解吸而且不利于实际应用 一般而言 生物吸 附剂需要 2 4 h 或更长的时间才能达到最佳的吸附效果 这也是影响生物吸附 法实际应用的主要因素 25 26 大多数学者都认为生物材料吸附重金属离子分为 两个阶段 第一个阶段为快速吸附阶段 通常在几十分钟甚至几分钟内即达到 最终吸附量的 70 左右 第二个阶段为慢速吸附阶段 在这一阶段常常需要几 个小时才能达到最终吸附量 快速吸附阶段数据可以用一级动力学方程拟合 吕英等 27 开展了 EPS 对水中 Cu2 的吸附研究 结果表明 EPS 对 Cu2 的吸附过 程经历了快速吸附阶段 一级动力反应动力学阶段 吸附 解吸平衡阶段 对于 在 8 40 min 内 EPS 对 Cu2 的吸附具有一级反应特征 2 3 2 pH 值的影响 通常认为溶液的 pH 值是影响生物吸附最显著的因素 pH 值不仅影响吸附 剂的吸附位点的存在状态 而且影响金属离子的化学性质 EPS 表面的自由位 点数是受 pH 值控制的 pH 过小时 EPS 表面上的自由点位和水合氢离子 H3O 紧紧贴在一起 H3O 与金属离子争夺吸附位点 从而限制了金属离子的 靠近 影响了吸附效果 随着 pH 值的升高 EPS 的吸附点电负性增强 因而 对金属阳离子的吸附性能得到提高 当 pH 过高时 一方面金属离子在水中将 被各种阴离子包围 形成带负电的基团 不易和带负电的吸附位点结合 另一 方面重金属离子会以不溶解的氧化物 氢氧化物微粒的形式存在 从而使吸附 过程无法进行 在弱酸向弱碱转变过程中 会暴露更多的吸附基团 有利于重 金属离子的吸附 对大多数吸附体系而言一般是随着 pH 值的增大 生物吸附 量增加 当 pH 接近 6 时 吸附量又开始下降 因为大多数重金属在 pH 5 5 时开始发生沉淀 所以在 pH 较高时 金属离子可能在细胞内或细胞外发生微 沉积 然而 有实验表明当用酸洗之后的吸附剂吸附重金属时 吸附体系的 pH 值会降低 R COOH 可以与金属发生离子交换 从而氢离子就进入溶液当中 使得溶液中的 pH 值降低 除了 R COOH 外 还有岩藻聚多糖和角叉菜胶中的 R OSO3 真菌细胞壁上的壳多糖和壳三糖中的氨基官能团 R2 NH 和 R NH2 但是氨基官能团吸附重金属时达到最大吸附容量时的 pH 值往往要高于羧基官 能团 基于酸碱平衡理论 金属离子的吸附主要依靠于吸附剂表面上弱酸基团 的离解状态 28 2 3 3 温度的影响 温度对吸附的影响主要是通过影响生物吸附剂的生理代谢活动 基团吸附 热动力和吸附热容等因素 进而影响吸附效果 一般来说 吸附过程是一个放 热过程 略微升高温度有利于生物吸附 而较大幅度升高则不利于生物吸附 同时过高或过低都会使饱和吸附量有所降低 对于不同金属离子 温度对于 EPS 吸附的影响有所不同 众多资料表明 EPS 中起吸附作用的主要是多糖 温 度对多糖的影响不是很大 吴涓等 29 研究了温度对白腐真菌吸附 Pb2 的影响 结果表明 28 和 35 时的吸附率分别为 95 62 和 94 81 40 时的吸附 率为 82 49 Norcardia amarae 菌 30 对水相中 Pb2 的吸附试验中 在温度范围 为 10 50 内 Pb2 去除率均在 90 以上 温度对该吸附效果的影响不大 2 3 4 EPS 用量对吸附的影响 众多资料表明 在一定范围内 EPS 的投加量越多 则金属离子的去除效 率越高 至吸附饱和 继续投加 EPS 去除效率基本保持一定的水平 所以在 实际应用过程中既要保证重金属离子的去除效果 又要考虑吸附剂用量的经济 性 找到最佳的重金属离子量与 EPS 投加量的比例值 吕英 27 对 EPS 吸附 Cu2 的研究结果表明 EPS 的投加量为 16 mg g 田禹等 12 对剩余活性污泥 EPS 对水中 Cd2 和 Zn2 的吸附效能研究结果表明 EPS 的最佳投加量分别为 375 mg L 和 250 mg L 2 3 5 金属离子初始浓度的影响 在不同的初始浓度下 吸附率和吸附量与初始浓度均不呈线性关系 即当 吸附率达到最大时 吸附量并不是最大 因此 在考虑这个因素时 应该把生 物量也考虑在内 在一定范围内 重金属离子浓度与生物量的比值 C0 M 越大 则单位吸附剂的吸附量越大 直至吸附饱和 同时 C0 M 值的选取要兼顾重金 属的有效去除与吸附剂的充分利用 适当提高 C0 M 值有利于吸附剂的有效利 用 31 2 3 6 共存离子的影响 当吸附体系中存在其它金属离子时 一般都会抑制主要金属离子的吸附 由前述机理可知 这些共存离子必然要与主要金属离子竞争细胞上有限的负电 性官能团 故导致主要金属离子吸附量的减少 吸附溶液中存在的阳离子会与 目标金属离子竞争吸附位点 从而对吸附产生干扰 如董德明等 32 研究发现 EPS 中锰的存在会影响其对 Pb2 和 Cd2 的吸附 苏春彦等 33 研究发现 Pb2 的存 在会影响胞外多糖对 Cd2 的吸附 但是阴离子会对吸附产生何种影响要视具体 情况而定 海洋巨藻吸附 Hg2 时 Cl 对其就产生很大的影响 用壳聚糖处理含 重金属离子废水时 发现阳离子 Na Mg2 K Ca2 和 Cl SO32 HCO3 CO32 等阴离子对金属离子的吸附容量无影响 Texier 等 34 研究发现 溶液中 的 NO3 SO42 Cl 对铜绿假单胞菌吸附镧系离子没有影响 第三章 材料与方法 3 1 硫酸盐还原菌的培养 实验所用培养基是 Starkey 培养基 具体成分为 K2HPO4 0 5 g NH4Cl 1 0 g Na2SO4 0 5 g CaCl2 6H2O 0 1g MgSO4 7H2O 2 0 g 70 乳酸纳 5 0 mL 蒸馏水 1000 mL 抗坏血酸 1 pH 7 0 0 2 菌液接种量为 10 并于 无菌条件下向培养基中充氮气以排除氧气 置于 35 恒温培养箱中无氧培养 3 2 胞外聚合物的提取及分析 3 2 1 胞外聚合物的提取方法比较 目前对各种微生物 EPS 的提取还没有一个标准的方法 需根据所研究对象 的去选择一个适合的提取方法 经过近几十年的不断探索与尝试 人们已研究 出十多种胞外聚合物提取方法 见表 1 这些方法可大致分为两大类 一类是 物理方法 一类是化学试剂法 35 物理提取法主要是利用各种外力 如超声波提供的冲击力 离心提供的离 心力促进 EPS 和微生物细胞分离 使之溶于水相中 其中常规低速离心一般不 能用来提取结合型 EPS 它经常用于提取后期将提取的 EPS 和细胞分开 采用 物理方法提取的 EPS 产率一般较化学法或两者结合法要低 化学方法是指加入不同的化学物质到微生物样品中 打断 EPS 基质中的键 合 加速 EPS 释放到溶液中 从而将 EPS 提取出来 表1 胞外聚合物的提取方法汇总表 类 别 方法操作 超声波法 利用超声波造成空穴 产生压力冲击 在这种冲击力的作用下 提 取生物膜的胞外聚合物 超声离心法 该方法是超声法与离心法的结合 生物膜胞外聚台物在超声冲击力 和重力场共同作用下加速其各成分的溶解 蒸气提取 利用蒸汽提供的热量与压力增大生物膜各成分的运动速度 从而增 大其在溶液中溶解度 达到提取与分离目的 物 理 法 常规离心 在离心产生的重力场作用下 加速颗粒沉降速度 增大胞外聚合物 各成分在水溶液中的溶解度 NaOH提取 生物膜样品在2 000 g的离心力下离心20 min 上清液被弃掉 加入2 mL 2 mol L的NaOH于沉积物中 在20 下轻轻搅动5 h 然后用水稀 释到原始样体积 使离心和分离效果更好 样品在大约2 000 g下离 心并除去沉积物 EDTA提取 将质量分数为2 的EDTA 四钠盐 加入生物膜样品中 在4 下放置 3 h 然后在4 14 000 g下 离心20 min 乙醇提取 生物膜样品中加入适量的已醇混合均匀后 放入密闭容器 放置 1 16 d 然后将该悬浮液置离心机中低速 1 800 g 离心10 min 磷酸缓冲液提取 生物膜样品中加入一定量的磷酸缓冲液 pH 7 0 0 01 mol L 在70 的水浴中以100 r min速度轻搅2 4 h Tris HCl 生物膜样品中先加入一定量的Tris HC1缓冲液中 pH 7 0 0 1 mol L 该混合液置80 水浴中1 h 阳离子交换树脂 在生物膜样品中先加入一定量的提取缓冲液 提取缓冲液配制 2 mmol Na3P04 4 mmol NaH2PO4 9 mmol NaCl和1 mmol KCl配制成1 L溶液 然后再加入Dowex离子交换树脂 50 8 Na 形式 20 50筛 目 Aldrich Fluka44445 在 4 下搅动2 h 甲醛提取 生物膜样品中加入25 mL含0 22 甲醛的氯化钠溶液 8 5 该混合 物在12 000 g下离心30 min 化 学 法 戊二醛提取 根据生物膜样品菌种的不同 加入适量的戊二醛溶液 3 在4 下搅拌 100 r min 过夜 一般纯粹采用化学法或物理法提取 EPS 的效率都不高 常用的提取方法一 般都是物理 化学相结合的方法 如用离子交换树脂 搅拌 36 HCHO 超声法 离子交换树脂 超声 另外 通过外加交流电也有助于提高 EPS 提取效率 37 3 2 2 提取方法评价指标 衡量一个提取方法成功与否 一般从三个方面进行描述 提取效率 细胞 溶解程度和聚合物的破坏程度 提取效率一般定义为提取的 EPS 量占微生物中总有机物质的比例 或提取 的 EPS 的量占总 EPS 量的比例 采用不同提取方法从同一个样品中提取 EPS 提取效率有很大的差别 目前文献报道较好的方法是 离子交换树脂法 EDTA 法 超声 甲醛 NaOH 法 每一种 EPS 提取方法都会或多或少导致部分细胞溶解 对细胞溶解程度的 判断 以前有用蛋白质或 DNA 的含量来判断提取过程中细胞的溶解程度 但 这不是一个适当的方法 因为对有的 EPS 来说 蛋白是其主要成分 而一般 EPS 中也含有少量的 DNA 但过多的 DNA 往往意味着该提取方法对细胞破坏 较严重 三磷酸腺苷 ATP 也可以用来作为细胞内物质的标记 11 但 ATP 含 量的测量缺少很好的精确度 一些胞内酶也可以作为指示物 如葡萄糖 6 磷酸 脱氢酶 也用文献报道测量 EPS 提取前后细胞数目的变化 但是细胞数目仅仅 可以用来反应细胞是否被破坏 而不能用来估计细胞内物质的泄漏程度 有人 提出用紫外可见光谱来反应细胞的破坏程度 并成功用于光合细菌的提取方法 选择上 一般 NaOH 处理和热处理能够加剧细胞溶解 而离子交换和 EDTA 法对细胞的破坏作用较小 22 在提取过程中 通常 EPS 中大分子键会发生断裂 煮沸和碱处理都会加剧 大分子键断裂 NaOH 处理时 当 pH 9 也会发生会结导致二硫键的断裂和 糖醛酸的降解 而离子交换方法一般不会使大分子降解 一些细胞胞外酶在提 取过程中 也会改变大分子的结构和特性 所以可能的情况下 整个提取过程 都应该在冰浴中进行 也可以加入一些抑制剂来减少水解的发生 如蛋白酶抑 制剂 大分子成分的改变可以通过凝胶渗透色谱或高效体积排阻色谱来确定 3 2 3 胞外聚合物的提取 EPS 的提取按图 1 的步骤进行 得实验所用 EPS 于冰箱中冷冻保存 4000 rpm 下离心 15 min 取沉淀物定容至原体积 定容至原体积 4000 rpm 下离心 15 min 取沉淀物定容至原体积 定容至原体积 80 水浴中加热 10 min 冷却 冷却 14000 rpm 下离心 15 min 取上清液用 0 22um 的纤维素膜过滤 0 22 m 的纤维素膜过滤 14000 rpm 下离心 15 min 35mL 菌液 定容至原体积 图 1 EPS的提取步骤 3 2 4 胞外聚合物的分析 1 多糖的测定 多糖浓度的测定采用蒽酮法 首先制作标准曲线 取 7 支干燥洁净的试管 分别加入葡萄糖标准液 0 0 1 0 2 0 3 0 4 0 6 0 8 mL 浓度为 100 g mL 用蒸馏水定容至 1 mL 在每支试管中立即加入蒽酮试剂 4 0 mL 迅速浸于冰水 浴中冷却 各管加完后一起浸于沸水浴中 管口加盖 以防蒸发 自水浴重新 煮沸起 准确煮沸 10 min 取出 用冰浴冷却至室温 在 620 nm 波长下以第一 管为空白 迅速测其余各管吸光值 以标准葡萄糖含量 g 为横坐标 以吸 光值为纵坐标 作出标准曲线如图 2 020406080 0 0 0 1 0 2 0 3 0 4 吸光度 葡萄糖含量 mg L Equation y a b x Weight No Weightin Residual Sum of Squares 1 1071E 4 Adj R Square 0 99885 ValueStandard Erro B Intercept 0 001710 00294 B Slope0 004916 81214E 5 图 2 葡萄糖标准曲线 然后吸取 1 ml 已稀释的提取液于试管中 加入 4 0 ml 蒽酮试剂 平行两份 空白管以等量蒸馏水取代提取液 以下操作同标准曲线制作 根据 A620 平均 值在标准曲线上查出葡萄糖的含量 g 2 蛋白浓度测定 Lowry 法 首先是标准曲线的测定 取 16 支大试管 1 支作空白 3 支留作未知样品 其余试管分成两组 分别加入 0 0 1 0 2 0 4 0 6 0 8 1 0 mL 标准蛋白质 溶液 浓度为 250 g mL 用水补足到 1 0 mL 然后每支试管加入 3 mL 试剂 滤液置入 3500 Da 的半透膜中透析 24 小时获得样品 的半透膜中透析 24 h 获取 EPS 样品 甲 在旋涡混合器上迅速混合 于室温 20 25 放置 10 min 再逐管加入 0 3 mL 试剂乙 Folin 酚试剂 同样立即混匀 这一步混合速度要快 否则 会使显色程度减弱 然后在室温下放置 30 min 以未加蛋白质溶液的第一支试 管作为空白对照 于 750 nm 处测定各管中溶液的吸光度值 以蛋白质的量为横 坐标 吸光度值为纵坐标 绘制出标准曲线 0 00 10 20 30 40 50 6 0 50 100 150 200 吸光度 蛋白质浓度 mg L Equation y a b x Weight No Weightin Residual Sum of Squares 60 81051 Adj R Square 0 99744 ValueStandard Erro B Intercept 12 224132 76349 B Slope374 902758 49252 图 3 蛋白质标准曲线 然后是样品的测定 取 1 mL 样品溶液 其中约含蛋白质 20 250 g 按 上述方法进行操作 取 1 mL 蒸馏水代替样品作为空白对照 通常样品的测定 也可与标准曲线的测定放在一起 同时进行 即在标准曲线测定的各试管后面 再增加 3 个试管 如上表中的 8 9 10 试管 根据所测样品的吸光度值 在标 准曲线上查出相应的蛋白质量 从而计算出样品溶液的蛋白质浓度 3 核酸浓度的测定 采用紫外吸收法 实验原理 核酸及其衍生物 核苷酸 核苷 嘌呤和嘧 啶有吸收 UV 的性质 其吸收高峰在 260nm 波长处 核酸的摩尔消光系数 或 称吸收系数 用来表示 为每升溶液中含有 1 克原子核酸磷的光吸收值 即 A 值 测得未知浓度核酸溶液的 A260nm 值 即可以计算出其中 RNA 或 DNA 的含量 该法操作简便 迅速 并对被测样品无损 用量也少 在本实验中 1mL 待测液中制品量为 50 g 实验步骤如下 1 准确称取待测核酸样品 0 5g 加少量 0 01mol L NaOH 调成糊状 再加适 量水 用 5 6 氨水调至 pH7 0 定容至 50mL 2 取两支离心管 甲管加入 2mL 样品溶液和 2mL 蒸馏水 乙管加入 2mL 样品溶液和 2mL 沉淀剂 混匀 在冰浴上放置 30min 3 在 3000r min 下离心 10min 从甲 乙两管中分别吸取 0 5 mL 上清液 用蒸馏水定容至 50mL 选择厚度为 1cm 的石英比色杯 在 260 nm 波长处测定 A 值 A 0 026 即为核酸浓度 4 测定 A280 的值 求出 A260 A280 判断 RNA 的纯度 3 3 金属溶液的准备 溶液的制备是用浓硝酸分别溶解铜粉和锌粉制得 然后将铜离子的浓度稀 释至 1 mg L 2mg L 3mg L 4mg L 5mg L 锌离子的浓度稀释至 0 1mg L 0 2mg L 0 3mg L 0 4mg L 0 5mg L 保存于玻璃瓶中 以供制作标 准曲线之用 再另一部分用去离子水稀释到一定浓度作为储备液 以获得每次 实验前所需的工作溶液浓度 3 4 吸附实验过程 3 4 1 最佳吸附时间确定 在吸附实验中 10 毫升的胞外聚合物溶液 32 1mg L 被放置在一个 3500 Da 的透析袋中 并悬浮在含有 50 毫升的 Cu2 或 Zn2 溶液的干净烧杯中 Cu2 和 Zn2 的浓度都取 10mg L pH 取 5 0 实验在室温下进行 而从溶液中取样的 时间间隔为 0 15 30 45 60 120 240 360 480 600 720 1440 分钟 每组做一份平行样 作为空白实验 胞外聚合物更换为等体积的去离子水 吸 附过后 将透析袋移到有去离子水的干净烧杯中 这样可以消除任何松散结合 的金属离子 每个金属络合的胞外聚合物溶液转移到一个干净的容量瓶中 用 去离子水稀释 以达到金属离子进行测量所需的浓度 3 4 2 最佳 pH 的确定 为了确定 pH 值如何影响金属离子吸附到胞外聚合物 将含有 10mL 胞外 聚合物溶液的透析袋悬浮在不同的初始 pH 1 0 5 0 的金属溶液里 这是因为 根据溶度积计算 当铜离子的溶度为 0 1mol L 时 pH 4 7 既可以开始沉淀 当 pH 6 7 时 溶液中的铜离子溶度可降低到 0 00001mol L 故在本实验中 pH 最大取为 5 0 接触时间由 2 4 1 确定 Cu2 和 Zn2 的浓度仍取 10mg L 用 0 1mol L HCL 和 0 1mol L 的 NaOH 调节其初始 pH 分别为 1 0 2 0 3 0 4 0 5 0 其它实验条件同上 3 4 3 吸附等温线绘制 根据大量的实验结果 人们曾提出过许多描述吸附的物理模型及等温线方 程 但应用较广泛的是 Langmuir 吸附等温模型和 Freundlich 模型 Langmuir 吸附等温模型是假定一个单分子层吸附 在具体均匀位点的生物 吸附 Langmuir 吸附等温线已成功应用于许多污染物的吸附过程 特别是从 液体溶液中溶质的等温吸附 该理论的基本假设有 1 单分子层吸附 2 固体表面是均匀的 3 被吸附在固体表面上的分