脯氨酸含量的测定

脯氨酸含量的测定脯氨酸含量的测定 在逆境条件下 植物体内脯氨酸 proline Pro 的含量显著增加 植物体内脯氨酸含 量在一定程度上反映了植物的抗逆性 抗旱性强的品种往往积累较多的脯氨酸 因此测定 脯氨酸含量可以作为抗旱育种的生理指标 另外 由于脯氨酸亲水性极强 能稳定原生质 胶体及组织内的代谢过程 因而能降低凝固点 有防止细胞脱水的作用 在低温条件下 植物组织中脯氨酸含量增加 可提高植物的抗寒性 因此 亦可作为抗寒育种的生理指标 一 原理 当用磺基水杨酸提取植物样品时 脯氨酸便游离于磺基水杨酸的溶液中 然后用酸性 茚三酮加热处理后 溶液即为红色 再用甲苯处理 则色素全部转移至甲苯中 色素的深 浅即表示脯氨酸含量的高低 在 520nm 波长下比色 从标准曲线上查出 或用回归方程计 算 脯氨酸的含量 二 材料 仪器设备及试剂 一 材料 待测植物叶片 二 仪器设备 1 722 型分光光度计 2 研钵 3 100ml 小烧杯 4 容量瓶 5 大试管 6 普通试管 7 移液管 8 注射器 9 水浴锅 10 漏斗 11 漏斗架 12 滤纸 13 剪刀 三 试剂 1 酸性茚三酮溶液 将 1 25g 茚三酮溶于 30ml 冰醋酸和 20ml 6mol l 磷酸中 搅拌加 热 70 溶解 贮于冰箱中 2 3 磺基水杨酸 3g 磺基水杨酸加蒸馏水溶解后定容至 100ml 3 冰醋酸 4 甲苯 三 实验步骤 1 标准曲线的绘制 1 在分析天平上精确称取 25mg 脯氨酸 倒入小烧杯中内 用少量蒸馏水溶解 然 后倒入 250ml 容量瓶中 加蒸馏水定容至刻度 此标准液中每毫升含脯氨酸 100ug 2 系列脯氨酸浓度的配置 取 6 个 50ml 容量瓶 分别加入脯氨酸原液 0 5ml 1 0ml 1 5ml 2 0ml 2 5ml 及 3 0ml 用蒸馏水定容至刻度 摇匀 各瓶的脯氨酸 浓度分别为 1ug ml 2ug ml 3ug ml 4ug ml 5ug ml 及 6ug ml 3 取 6 支试管 分别吸取 2ml 系列标准浓度的脯氨酸溶液及 2ml 冰醋酸和 2ml 酸 性茚三酮溶液 每管在沸水浴中加热 30min 4 冷却后各试管准确加入 4ml 甲苯 振荡 30s 静置片刻 使色素全部转至甲苯溶 液 5 用注射器轻轻吸取各管上层脯氨酸甲苯溶液至比色杯中 以甲苯溶液为空白对 照 于 520nm 波长处进行比色 6 标准曲线的绘制 先求出吸光度值 Y 依脯氨酸浓度 X 而变的回归方程式 再按回归方程式绘制标准曲线 计算 2ml 测定液中脯氨酸的含量 ug 2ml 2 样品的测定 1 脯氨酸的提取 准确称取不同处理的待测植物叶片各 0 5g 分别置大管中 然后 向各管分别加入 3 的磺基水杨酸溶液 5ml 在沸水浴中提取 10min 提取过程中要经常摇 动 冷却后过滤于干净的试管中 滤液即为脯氨酸的提取液 2 吸取 2ml 提取液于另一干净的带玻塞试管中 加入 2ml 冰醋酸及 2ml 酸性茚三 酮试剂 在沸水浴中加热 30min 溶液即呈红色 3 冷却后加入 4ml 甲苯 摇荡 30s 静置片刻 取上层液至 10ml 离心管中 在 3000r min 下离心 5min 4 用吸管轻轻吸取上层脯氨酸红色甲苯溶液于比色杯中 以甲苯为空白对照 在 分光光度计上 520nm 波长处比色 求得吸光度值 四 结果计算 根据回归方程计算出 或从标准曲线上查出 2ml 测定液中脯氨酸的含量 X ug 2ml 然后计算样品中脯氨酸含量的百分数 计算公式如下 单位鲜质量样品的脯氨酸含量 x100 106 式中 X 为从标准曲线查出的 2ml 测定液中脯氨酸的含量 ug 2ml Vt 为提取液体积 ml Vs 为测定时取用的样品体积 ml W 为样品质量 g 植物体内硝酸还原酶活力的测定植物体内硝酸还原酶活力的测定 硝酸还原酶 NR 是植物氮素同化的关键酶 它催化植物体内的硝酸盐还原为亚硝 酸盐 NO3 NADH H NO2 NAD H2O 产生的亚硝酸盐与对 氨基苯磺酸 或对 氨基苯磺酰胺 萘胺 或萘基乙烯二胺 在酸性条件下定量生成红色偶氮化合物 生成的红色偶氮化合物在 540nm 有最大吸收峰 可用分光光度法测定 硝酸还原酶活 性可由产生的亚硝态氮的量表示 一般以 ug 氮 g h 为单位 NR 的测定可分为活体法 和离体法 活体法操作简单 适合快速 多组测定 离体法复杂 但重复性好 离体法离体法 一 材料 仪器设备及试剂一 材料 仪器设备及试剂 一 材料 水稻 小麦叶片 幼穗等 二 仪器设备 1 冷冻离心机 2 分光光度计 3 天平 感量 0 1mg 4 冰箱 5 恒温水浴 6 研钵 7 剪刀 8 离心管 9 具塞试管 10 移液管 11 吸尔球 三 试剂 1 亚硝酸钠标准溶液 准确称取分析纯 NaNO2 0 9857g 溶于去离子水后定容至 1000ml 然后再吸取 5ml 定容至 1000ml 即为含亚硝态氮 1ug ml 的标准液 2 0 1mol l pH7 5 的磷酸缓冲液 30 0905g Na2HPO4 12 H2O 与 2 4965g NaH2PO4 2 H2O 加去离子水溶解后定容至 1000ml 3 1 质量浓度 磺胺溶液 1 0g 磺胺溶于 100ml 3mol l 盐酸中 25ml 浓盐酸加水定 容至 100ml 即为 3mol l HCl 4 0 02 质量浓度 萘基乙烯胺溶液 0 0200g 萘基乙烯胺溶于 100ml 去离子水中 贮于棕色瓶内 5 0 1mol l KNO3 溶液 2 5275g KNO3 溶于 250ml 0 1mol l pH7 5 的磷酸缓冲液 6 0 025mol l pH8 7 的磷酸缓冲液 8 8640g Na2HPO4 12 H2O 0 0570g K2HPO4 3H2O 溶于 1000ml 去离子水中 7 提取缓冲液 0 1211g 半胱氨酸 0 0372g EDTA 溶于 100ml 0 025mol l pH8 7 的磷酸缓 冲液中 8 2mg ml NADH 溶液 2mg NADH 溶于 1ml 0 1mol l pH7 5 的磷酸缓冲液中 临用前配临用前配 制制 二 实验步骤二 实验步骤 一 标准曲线制作 取 7 支洁净烘干的 15ml 刻度试管按下表顺序加入试剂 配成 0 2 0ug 的系列标准亚硝 态氮溶液 摇匀后在 25 下保温 30min 然后在 540nm 下比色测定 以亚硝态氮 ug 为 横坐标 X 吸光度值为纵坐标 Y 建立回归方程 配置标准溶液时各物质加入量配置标准溶液时各物质加入量 试剂 ml 管 号 1 2 3 4 5 6 7 亚硝酸钠标准液 0 0 2 0 4 0 8 1 2 1 6 2 0 蒸馏水 2 0 1 8 1 6 1 2 0 8 0 4 0 1 磺胺 4 4 4 4 4 4 4 0 02 萘基乙烯胺 4 4 4 4 4 4 4 每管含亚硝态氮 ug 0 0 2 0 4 0 8 1 2 1 6 2 0 二 样品中硝酸还原酶活力测定 1 酶的提取 称取 0 5g 鲜样 剪碎于研钵中置于低温冰箱冰冻 30min 取出置于冰浴 中加少量石英砂及 4ml 提取缓冲液 研磨匀浆 转入离心管在 4 4000r min 下离心 15min 上清液即为粗酶提取液 2 酶的反应 取粗酶液 0 4ml 于 10ml 试管中 加入 1 2ml 0 1mol l KNO3 磷酸缓冲液和 0 4ml NADH 溶液 混匀 在 25 水浴中保温 30min 对照不加 NADH 溶液 而以 0 4ml 0 1mol l pH7 5 的磷酸缓冲液代替 3 终止反应和比色测定 保温结束后立即加入 1ml 磺胺溶液终止酶反应 再加 1ml 萘 基乙烯胺溶液 显色 15min 后于 4000r min 下离心 15min 取上清液在 540nm 下比色测定 根据回归方程计算出反应液中所产生的亚硝态氮总量 ug 三 结果计算三 结果计算 样品中硝酸还原酶活性 ug g h 其中 x 为反应液酶催化产生的亚硝态氮总量 ug VT 为提取酶时加入的缓冲液体积 ml Vs 为酶反应时取用的粗酶液体积 ml W 为样品鲜质量 g t 为反应时间 h 根系活力的测定 根系活力的测定 TTC 法 法 植物根系是活跃的吸收器官和合成器官 根的生长情况和活力水平直接影响地上部分 的生长 营养状况及产量水平 一 原理一 原理 氯化三苯基四氮唑 TTC 是标准氧化还原电位为 80mV 的氧化还原色素 溶于水中成 为无色溶液 但还原后即生成红色而不溶于水的三苯甲腙 生成的三苯甲腙比较稳定 不会被空气中的氧自动氧化 所以 TTC 被广泛地用作酶试 验的氢受体 植物根系中脱氢酶所引起的 TTC 还原 可因加入琥珀酸 延胡索酸 苹果酸 得到增强 而被丙二醛 碘乙酸所抑制 所以 TTC 还原量能表示脱氢酶活性并作为根系活 力的指标 二 材料 设备仪器及试剂二 材料 设备仪器及试剂 一 材料 水培或沙培小麦 玉米等植物根系 二 仪器设备 1 分光光度计 2 分析天平 感量 0 1mg 3 电子顶载天平 感量 0 1g 4 温箱 5 研钵 6 50ml 三角瓶 7 漏斗 8 100ml 量筒 9 10ml 吸量管 10 10ml 刻度试管 11 试管架 12 10ml 容量瓶 13 药勺 14 石英砂适量 15 10ml 1000ml 烧杯 三 试剂 1 乙酸乙酯 分析纯 2 次硫酸钠 Na2S2O4 分析纯 粉末 3 1 TTC 溶液 准确称取 TTC1 0g 溶于少量水中 定容至 100ml 用时稀释至所需要 的各种浓度 4 磷酸缓冲液 1 15mol l pH7 准确称取 9 067g 磷酸二氢钾 KH2PO4 加 1mol l NaOH 溶液 38 8ml 并加水定容至 1000ml 或者 1 15mol l 的磷酸氢二钠 称取 Na2HPO4 12 H2O 23 88g 蒸馏水定容至 1000ml 1 15mol l 的磷酸二氢钾 称取分析纯 KH2PO4 9 07g 用纯水定容至 1000ml pH7 的磷酸缓冲液即为取 1 15mol l 的磷酸氢二钠 12ml 1 15mol l 的磷酸二氢钾 8ml 两者混合即可 5 1mol l 硫酸 用量筒取相对质量 1 84 的浓硫酸 55ml 边搅拌边加入盛有 500ml 蒸馏 水的烧杯中 冷却后稀释至 1000ml 三 实验步骤三 实验步骤 定量测定 1 TTC 标准曲线的制作 取 0 4 TTC 溶液 0 25ml 放入 10ml 试管中 加少许 Na2S2O4 粉末摇匀后立即产生红色的甲腙 再用乙酸乙酯定容至刻度 摇匀 然后分别取 此液 0 25ml 0 50ml 1 00ml 1 50ml 2 00ml 置于 10ml 容量瓶中 用乙酸乙酯定容至刻 度 即得到含甲腙 25ug 50ug 100ug 150ug 200ug 的标准比色系列 以空白作参比 在 485nm 波长下测定吸光度 绘