基因治疗的原理.ppt

基因治疗的原理 一 基因治疗的策略 内容提要 二 基因转移技术 三 基因干预 一 基因治疗的策略 一 基因置换 genereplacement 定义 指将特定的目的基因导入特定细胞 通过定位重组 以导入的正常基因置换基因组内原有的缺陷基因 目的 将缺陷基因的异常序列进行桥正 二 基因添加 基因添加或称基因增补 geneaugmentation 通过导入外源基因使靶细胞表达其本身不表达的基因 类型 在有缺陷基因的细胞中导入相应的正常基因 而细胞内的缺陷基因并未除去 通过导入正常基因的表达产物 补偿缺陷基因的功能 向靶细胞中导入靶细胞本来不表达的基因 利用其表达产物达到治疗疾病的目的 三 基因干预基因干预 geneinterference 采用特定的方式抑制某个基因的表达 或者通过破坏某个基因的结构而使之不能表达 以达到治疗疾病的目的 四 自杀基因治疗自杀基因治疗 恶性肿瘤基因治疗的主要方法之一 原理 将 自杀 基因导入宿主细胞中 这种基因编码的酶能使无毒性的药物前体转化为细胞毒性代谢物 诱导靶细胞产生 自杀 效应 从而达到清除肿瘤细胞的目的 五 基因免疫治疗 通过将抗癌免疫增强细胞因子或MHC基因导入肿瘤组织 以增强肿瘤微环境中的抗癌免疫反应 二 基因转移技术 基因转移 genetransfer 技术 1 病毒介导的基因转移系统 2 非病毒介导的基因转移系统 1 病毒介导的基因转移系统 病毒载体介导的基因转移效率较高 因此它也是使用最多的基因治疗载体 据统计 有72 的临床实验计划和71 的病例使用了病毒载体 其中用得最多的是逆转录病毒载体 1 逆转录病毒载体 逆转录病毒载体的特点 逆转录病毒包膜上由env编码的糖蛋白 能够被许多哺乳动物细胞膜上的特异性受体识别 从而使逆转录病毒携带的遗传物质高效地进入靶细胞 逆转录病毒结构基因gag env和pol的缺失不影响其他部分的活性 前病毒可以高效整合至靶细胞基因组中 有利于外源基因在靶细胞中的永久表达 包装好的假病毒颗粒 携带目的基因的重组逆转录病毒载体 以芽生的方式分泌至辅助细胞培养的上清液中 易于分离制备 逆转录病毒载体的主要缺点 随机整合 有插入突变 激活癌基因的潜在危险 逆转录病毒载体的容量较小 只能容纳7kb以下的外源基因 2 腺病毒 adenovirus AV 载体腺病毒是一种大分子 36kb 双链无包膜DNA病毒 它通过受体介导的内吞作用进入细胞内 然后腺病毒基因组转移至细胞核内 保持在染色体外 不整合进入宿主细胞基因组中 腺病毒是人类呼吸道感染的病原体 但目前尚未发现与肿瘤发生有关联 宿主细胞范围广 可感染分裂和非分裂终末分化细胞 如神经元等 腺病毒载体的优点 1 基因导入效率高 对人类安全 2 宿主范围广 3 基因转导与细胞分裂无关 4 重组腺病毒可通过口服经肠道吸收 或喷雾吸入或气管内滴注 5 腺病毒载体容量较大 可插入7 5kb外源基因 腺病毒载体的缺点 2 宿主的免疫反应导致腺病毒载体表达短暂 3 有两个环节可能产生复制型腺病毒 4 靶向性差 1 不能整合到靶细胞的基因组DNA中 分裂增殖快的细胞 导入的重组病毒载体 随分裂而丢失的机会增多 表达时间相对较短 2 非病毒载体介导的基因转移系统 1 脂质体介导的基因转移技术脂质体介导的基因转移技术使用方便 成本低廉 基本原理 利用阳离子脂质体单体与DNA混合后 可以自动形成包埋外源DNA的脂质体 然后与细胞一起孵育 即可通过细胞内吞作用将外源DNA 即目的基因 转移至细胞内 并进行表达 2 受体介导转移技术 将DNA与细胞或组织亲和性的配体偶联 可使DNA具有靶向性 这种偶联通常通过多聚阳离子 如多聚赖氨酸 来实现 多聚阳离子与配体共价连接后 又通过电荷相互作用与带负电荷的DNA结合 将DNA包围 只留下配体暴露于表面 这样形成的复合物可被带有特异性受体的靶细胞吞饮 从而将外源DNA导入靶细胞 3 基因直接注射技术不需要进行基因工程的繁琐操作 直接将裸露基因DNA注入动物肌肉或某些器官组织内 三 基因干预 基因干预的种类 1 反义RNA antisenseRNA 2 干扰RNA RNAinterference 一 反义RNA1 反义RNA与基因表达调控利用反义RNA对体外培养的细胞进行基因表达调控 通常采用的方法有两种 1 体外合成反义RNA 直接作用于培养细胞 细胞吸收RNA后 发挥作用 2 构建能转录反义RNA的重组质粒 将质粒转入细胞 转录出反义RNA而发挥作用 2 受体介导反义RNA技转移术 基本原理 将脱唾液酸血清类粘蛋白 ASGP 与多聚赖氨酸 PL 共价连接 得到ASGP PL复合物 成为运载核酸的工具 ASGP PL反义RNA复合物可以专一性地被肝细胞表面的ASGP受体所识别 并吞噬到肝细胞中 反义RNA进入肝细胞后 可被逐渐释放出来发挥作用 借助受体介导DNA转移方法把DNA换成反义RNA 就可以实现受体介导的反义RNA的转移 二 干扰RNA 1 RNA干扰现象 RNA干扰 RNAinterference RNAi 是一种由双链RNA诱发的基因沉默现象 在此过程中 与双链RNA有同源序列的信使RNA mRNA 被降解 从而抑制该基因的表达 2 RNA干扰的机制 RNA干扰过程主要有2个步骤 1 小干扰性RNA siRNA 2 siRNA与细胞内的某些酶和蛋白质形成复合体 称为RNA诱导的沉默复合体 RNA inducedsilencingcomplex RISC 该复合体可识别与siRNA有同源序列的mRNA 并在特异的位点将该mRNA切断 长双链RNA被细胞内的双链RNA特异性核酸酶Dicer切成21 23个碱基对的短双链RNA 称为小干扰性RNA smallinterferingRNA siRN