逆境胁迫对植物生理生化代谢的影响

1 7 逆境胁迫对植物生理生化代谢的影响逆境胁迫对植物生理生化代谢的影响 摘要摘要 干旱 盐碱和低温是强烈限制作物产量的三大非生物因素 其中干旱造成 的损失最大 其损失超过其他逆境造成损失的总和 对植物产生伤害的环境称 为逆境 又称胁迫 常见的逆境有寒冷 干旱 高温 盐渍等 逆境会伤害植 物 严重时会导致植物死亡 逆境对植物的伤害主要表现在细胞脱水 膜系统 受破坏 酶活性受影响 从而导致细胞代谢紊乱 有些植物在长期的适应过程 中形成了各种各样抵抗或适应逆境的本领 在生理上 以形成胁迫蛋白 增加 渗透调节物质 如脯氨酸含量 提高保护酶活性等方式提高细胞对各种逆境的 抵抗能力 以小麦幼苗为材料 设置对照组 探究了干旱胁迫下脯氨酸 pro 谷胱甘肽 GSG 丙二醛 MDA H2O2 的含量变化以及抗氧化酶 POD PPO 活性 的变化 结果表明 在干旱胁迫下 脯氨酸 pro 谷胱甘肽 GSG 丙二醛 MDA H2O2 的含量相对于对照组均有较明显的上升趋势 POD 和 PPO 活性也表 现出较大水平的提高 关键词关键词 干旱胁迫 抗逆性 脯氨酸 丙二醛 样品 细胞膜透性 过氧化物酶 活性 叶绿素 可溶性糖 谷胱甘肽 抗氧化酶 H2O2 引言引言 干旱是我国农业可持续发展面临的主要问题之一 1 干旱胁迫对植物 的影响是一个复杂的生理生化过程 涉及到许多生物大分子和小分子植物细胞 膜起调节控制细胞内外物质交换的作用 它的选择透性是其最重要的功能之一 2 研究表明 游离的脯氨酸在植物细胞抵抗非生物胁迫过程中扮演着越来越 重要的角色 许多新的生理功能也逐渐被发现 近几年来有关脯氨酸的研究倍 受科学工作者的关注 9 13 干旱是一种最常见的胁迫 遇此逆境作物除进行气 孔调节外 渗透词节也不夹为一种有效方法 原理是通过加强合成代谢 增加 细胞内渗透物质浓度 降低渗透势 维持膨压和细胞正常生理功 能 脯氨酸作 为水溶性最大的氮基酸 162 3g 100g H 2O 25 oC 具有较强水合能力 是理想的渗透介质 作物遇旱时它的大量积累有助于细胞或组织持水 防止脱 水 故可视为作物对干早环境的一种保护性适应 已经证明了在逆境条件下脯 氨酸的积累来抵抗植物对非生物胁迫的伤害 植物体内的抗氧化酶系统也能将 伤害细胞的活性氧控制在可忍耐水平内 通过各种过氧化酶的协同作用 可以 把细胞内产生的具有很强氧化活性的活性氧如 O2 H2O2 OH 等直接或间接地 清除 防止了活性氧放大级联作用 保证了细胞内生命活动的正常进行 丙二 醛 MDA 是由于植物官衰老或在逆境条件下受伤害 其组织或器官膜脂质发生 过氧化反应而产生的 对干旱也具有抵抗作用 GSH 作为生物体内主要的还原 态硫之一 在生物体抵抗各种胁迫 冷害 干旱 重金属 真菌等 的过程中起 着重要的作用 其含量水平的高低与植物对各种环境胁迫的忍耐程度密切相关 近些年来 它在高等植物代谢过程中的生理作用 尤其是在植物抵御活性氧伤 2 7 害过程中的作用及其与植物抗逆性关系的研究进展很快 前人研究进展植物在 正常生长情况下 活性氧的产生和清除处于动态平衡状态 当植物在逆境条件 下 如干旱胁迫 生长时 这种平衡被打破 体内负责清除活性氧的抗氧化系 统能力下降 从而造成活性氧的大量积累 并引发或加剧膜脂过氧化作用 导 致生物膜系统受损 过氧化物酶 POD 多酚氧化酶 PPO 过氧化物 GSH 谷胱甘肽 等能够有效地清除这些自由基 是酶促防御系统的重要组成成分 人们根据这一理论对干旱胁迫下的许多作物如小麦 3 4 大豆 5 辣椒 6 胡杨 7 等逆境生理过程进行了研究 本实验切入点与其它作物相比 小麦在 干旱胁迫下具有独特的生存策略 是一种公认抗逆性较强的作物 利用干旱胁 迫处理小麦幼苗 测定其丙二醛 MDA 含量 GSH 含量 脯氨酸含量 H2O2含 量及 PPO POD 活性变化 探讨干旱胁迫对小麦幼苗膜脂过氧化及酶保护系统 的影响 为进一步明确大麦抗旱的生理机理提供一定理论依据 植物细胞膜对维持细胞的微环境和正常的代谢起着重要作用 在正常情况下 细胞膜对物质具有选择透性能力 当植物受到逆境影响时 如高温 干旱 盐 渍 病原菌侵染后 细胞膜遭到破坏 膜透性增大 从而使细胞内的电解质外 渗 以至于植物细胞侵提液的电导率增大 膜透性增大的程度与逆境胁迫强度 有关 也与植物抗逆性的强弱有关 1 1 材料与方法材料与方法 1 1 种子发芽率的测定的材料培养和处理 品种为晴 3 或鲁玉 13 的玉米种子或小麦种子 购于西山种子公司 用 0 1 HgCL2 消毒 10min 后 用蒸馏水漂洗干净 再用蒸馏水于 26 下吸胀 12h 后即可用于实验 1 2 主要试剂 0 1 HgCl2 TTC 3 磺基水杨酸 SSA 冰乙酸 茚三酮 PBS pH 7 8 0 6 TBA 用 0 6 TCA 配制 PBS pH 6 8 内含 1mMHA 0 1 Ti SO4 2 用 20 v v H2SO4配制 PBS pH 5 8 内含 0 mmol LEDTA 1 PVP POD 反应混合液 10 mmol L 愈创木酚 5 mmol L H2O2 用 PBS 溶解 PPO 反应混合液 20 mmol L 邻苯二酚 用 PBS 溶解 5 三氯乙酸 PBS pH 7 7 4 mM DTNB 用 0 1M pH 6 8PBS 现配 主要仪器 分光光度 仪 离心机 试管 微量加样器 研钵等 1 3 余下实验材料培养和处理 小麦种子吸胀 12h 在湿润滤纸上培养 7 天 正常组即对照组继续正常培养 干旱组即实验组再干旱处理五天后用于实验 2 方法方法 2 1 种子发芽率的测定 所采用的种子发芽率的测定方法是曙红染色法和 TTC 染色法 凡是有生命活力 的种子胚部 在呼吸作用过程中都有氧化还原反应 而无生命活力的种子胚则 无此反应 当 TTC 渗入种胚的活细胞内 并作为氢受体被脱氢辅酶 NADH2或 NADPH2 上的氢还原时 便由无色的 TTC 变为红色的 TTF 8 用曙红染色的 凡是全部着色或胚已着色的种子表示失去了生活力 播后不能发芽 生活力强的 种子是不会着色的 因为活细胞具有半透性膜 可防止染料分子通过而不着色 死 亡细胞 其壁膜失去半透性 染料分子易进入 使原生质着色 3 7 各取 50 粒吸胀的小麦种子 沿胚的中心线切成两半 严格区分两个半粒 进 行下列实验 其中 50 个半粒进行 TTC 染色 30 水浴 20 min 另 50 个半 粒进行曙红染色 室温染色 10 min 根据两种方法的染色情况 分别计算发芽 率 2 2 脯氨酸含量的测定 用茚三酮法测定脯氨酸含量 在酸性条件下 茚三酮与脯氨酸反应生成红色化 合物 在 520nm 下有最大吸收值 13 分别取 0 1 g 实验组和对照组的胚芽鞘 加入 3 mL 3 磺基水杨酸 SSA 和少许石英砂 充分研磨 用 2 mL 3 SSA 洗 研钵 5000 rpm 离心 10 min 上清液定容至 5 mL 上清液各 2 mL 分别加入 2 mL 冰乙酸和 2 mL 茚三酮试剂 煮沸 15 min 冷却后 5000 rpm 离心 10 min 分别测定 A520 2 3 MDA 含量 用硫代巴比妥酸法测定丙二醛含量 18 分别取 0 1 g 实验组和对照组 加入 3 mL 50mM PBS pH 7 8 和少许石英砂 充 分研磨 用 2 mL PBS 洗研钵 5000 rpm 离心 10 min 上清液定容至 5 mL 测定 分别取上清液各 2 mL 加入 0 6 TBA 用 0 6 TCA 配制 2 mL 煮沸 12 min 冷却后 5000 rpm 离心 10 min 分别测定 OD450 和 OD532 计算公式 OD450 C1 85 4 OD532 C1 7 4 155000 C2 求解方程得 C1 mmol L 11 71 OD450 C2 mol L 6 45 OD532 0 56OD450 式中 C1 为可溶性糖的浓度 C2 为 MDA 的浓度 2 4 抗氧化酶活性的测定 用愈创木酚法测定 POD 活性 用邻苯二酚法测定 PPO 活性 在有过氧化氢存在 的条件下过氧化物酶能使愈创木酚氧化 生成茶褐色物质 可用分光光度计测 量其含量 进而计算 POD 的活性 多酚氧化酶能使邻苯二酚氧化生成醌 用比 色法测量其产物的形成 进而计算出 PPO 的活性 POD 测定 取 POD 反应混合液 10mmol L 愈创木酚 5 mmol L H2O2 用 PBS 溶 解 3 00 ml 加入酶液 100 ml 空白调零用 PBS 取代 立即记时 摇匀 读 出反应 3 min 时的 A470 PPO 测定 取 PPO 反应混合液 20 mmol L 邻苯二酚 用 PBS 溶解 2 8 ml 加入酶液 0 2 ml 空白调零用 PBS 取代 立即记时 摇匀 读出反应 2 min 时的 A410 计算公式 POD activities mmol g 1FWmin 1 用 总 显 V V V tL A 470 PPO activities U g 1FW 用 总 V V tw A 01 0 410 2 5 H2O2 含量测定 4 7 H2O2 提取 分别取 0 5 g 实验组和对照组 加入 3 mL 50 mM PBS pH 6 8 内含 1mM HA 和少许石英砂 充分研磨 用 2 mL PBS 洗研钵 5000 rpm 离心 10 min 上清液定容至 5 mL 测定 分别取上清液各 3 mL 加入 0 1 Ti SO4 2 用 20 v v H2SO4 配制 1 mL 摇匀 5000 rpm 离心 10 min OD410 计算公式 H2O2 content mmol g 1FW 用 总 显 V V V WL A 410 3 3 结果与分析 结果与分析 3 1 种子发芽率的测定 分别计算两种方法的发芽率 小麦 TTC 法中 35 50 70 曙红染色法中 38 50 76 玉米 TTC 法中 36 50 72 曙红染色法中 32 50 64 3 2 脯氨酸含量的测定 实验组 A520 0 088 对照组 A520 0 060 计算公式 Pro content mol g 1FW 用 总 显 520 V V V WL A 其中 V 显 6ml V 总 5ml V 用 2ml 520 3 24mol 1 cm 1 L 1cm W 0 1g 计算结果 实验组脯氨酸含量为 4 074mol g 1FW 对照组脯氨酸含量为 2 777mol g 1FW 表一 Pro 正常组和实验组的 A520和 Pro content 干旱胁迫正常 A520 0 088 Procontent 4 074 mol g 1FW A520 0 060 Procontent 2 777 mol g 1FW 由上表可知 干旱胁迫下 脯氨酸的量是正常值的 1 47 倍 由此可以得到 干旱胁迫会造成脯氨酸的积累 但是 植物合成 累积及代谢是一个受非生物 胁迫的一个过程 因此 脯氨酸的积累可能是生物受胁迫的一个信号 当植物 处于干旱条件下时 为了保护植物对干旱逆境的反应 在干旱胁迫下 脯氨酸 的质量分数会急剧上升 而脯氨酸是水溶性最大的氨基酸 这表明它具有易于 水合的趋势或具有较强的水合能力 它的增加可能是植物对干旱胁迫的一种保 护性反应 3 3 MDA 含量 样品 TCC 方法 署红染色法 50 粒小麦种子 35 粒具生命力 38 粒具生命力 50 粒玉米种子 36 粒具生命力 32 粒具生命力 5 7 测得的结果如下表所示 OD450OD532 实验组1 500A0 454A 对照组0 380A0 201A 计算公式 OD450 C1 85 4 OD532 C1 7 4 155000 C2 求解方程得 C1 mmol L 11 71 OD450 C2 mol L 6 45 OD532 0 56OD450 式中 C1 为可溶性糖的浓度 C2 为 MDA 的浓度 最后计算得出浓度如下表 实验组对照组 C1 mmol L 17 5654 446 C2 mol L 2 0881 084 由上表可知 干旱胁迫下 丙二醛的浓度是正常情况下得 2 倍 因此 在干 旱胁迫也会造成 MDA 的积累 MDA 的最大特点是对细胞质膜和细胞中的许多物 质均有很强的破坏作用 因此 植物组织可能是通过产生并积累 MDA 等对细胞 有害物质 进而破坏植物组织 使植物在逆境坏境中生长不好 3 4 抗氧化酶的测定 POD 活性 实验组为 85 51 U g 1FW 对照组为 40 73 U g 1FW PPO 活性 实验组为 4 385 10 4 mmol g 1FWmin 1 对照组为 4 002 10 4 mmol g 1FWmin 1 表三 正常组和实验 PPO 和 POD 不同时间所测得值 PPO 和 POD 正常干旱胁迫 PPO A410 0 115 1 min20S PPO A410 0 126 1 min20S POD A470 1 16 1min20S POD A470 2 457 1 min20 s PPO activities 4320 U g 1FW PPO activities 4737 U g 1FW PODactivities 807 4 mol g 1FWmin 1 PODactivities 1710 2 mol g 1FWmin 1 以上数据是通过以下方程计算而得 6 7 用 总 显 V V V tW A 470 POD activities mol g 1FWmin 1 用 总 V V tW A 01 0 410 PP tivities U g 1FW 由上表可知 在干旱胁迫下 也会造成 PPO 和 POD 的积累 抗氧化酶的主要 作用是消除 ROS 对植物的伤害 使抗氧化酶与 ROS 处于一个动态平衡 在干旱 胁迫下 抗氧化酶总体增加 说明 这一个动态平衡体系被打破 使植物不能 消除 ROS 对自身的伤害 因而 逆境下植物生长不好 3 5 H2O2 的测定 表五 正常组和实验组 H2O2的 A410和 H2O2 content 正常干旱胁迫 A410 0 623A410 1 781 H2O2content 10 09 mol g 1FW H2O2 content 28 86 mol g 1FW 以上 H2O2 content 是通过以下公式计算而得 用 总 显 V V V WL A 410 H2O2content mol g 1FW 由上表可知 干旱胁迫下 也会造成过氧化氢的积累 过氧化氢是体内重要 的代谢产物 其积累对细胞具有氧化破坏作用 其含量的高低 一定程度上反 映了 CAT 活性的高低 因此 在干旱胁迫下 有可能是 CAT