第十章病毒分子生物学ppt课件.ppt

第十章病毒分子生物学 第一节病毒的类型及其侵染相关基因第二节病毒的侵染机制第三节病毒与受体的基因互作第四节病毒的侵染分子调控 病毒的概念病毒是一类亚显微细胞内寄生物颗粒 由预先合成的组份装配而成 不能自主生长或分裂 含有蛋白质 核酸和脂肪不具备能量代谢或蛋白质合成所必需的酶系和核糖体 需依赖寄主的酶系进行复制的有机组合体 第一节病毒的类型及其侵染相关基因 第一节病毒的类型及其侵染相关基因 一 病毒基因组的结构特点 1 与细菌或真核细胞相比 病毒的基因组很小 但是不同的病毒之间其基因组相差较大乙肝病毒 基因组DNA只有3 3 3kb 所含信息量也较小 只能编码4种蛋白质 痘病毒 基因组DNA达300kb 可以编码几百种蛋白质 包括病毒复制所需的酶类 以及核苷酸代谢的酶类 痘病毒对宿主的依赖性较乙肝病毒小得多 2 病毒基因组只能由一种核酸组成 或为DNA或为RNA DNA病毒的基因组多为双链 RNA病毒的基因组多为单链 DNA RNA ss ds Linear Circular Mono Multi Segmented与Divided 乳头瘤病毒 闭环的双链DNA病毒腺病毒 线性的双链DNA脊髓灰质炎病毒和SARS病毒 单链的RNA病毒呼肠孤病毒 由10 12条dsRNA构成 包被在同一种病毒粒子中 第一节病毒的类型及其侵染相关基因 3 病毒基因组中存在基因重叠现象 即同一片段能够编码2 3种蛋白质 这种现象类似于线粒体和质粒DNA 这样使较小的基因组携带更多的信息 重叠基因是1977年Sanger在研究 X174时发现的 X174噬菌体是一种单链DNA病毒 它感染大肠杆菌后共合成11种蛋白质分子 总分子量为250kDa左右 相当于6078个核苷酸所容纳的信息量 DNA本身只有5375个核苷酸 多能编码总分子量为200kDa的蛋白质分子 第一节病毒的类型及其侵染相关基因 基因重叠 完全重叠 部分重叠 两个基因只有一个碱基重叠 一个基因终止密码子的最后一个碱基是另一个基因起始密码子的第一个碱基 重叠的基因尽管其重叠部分的DNA相同 但是由于将mRNA翻译成蛋白质时的阅读框不一样 因此 产生的蛋白质分子并不相同 有些重叠的基因阅读框相同 只是起始部位不同SV40DNA基因组中 编码三个外壳蛋白VP1VP2VP3基因之间有122个碱基的重叠 它们有一段共同的序列 如 t抗原完全在T抗原基因里面 第一节病毒的类型及其侵染相关基因 4 病毒基因组的大部分是用来编码蛋白质的 只有非常小的一份不被翻译 不同于真核细胞DNA的冗余现象 X174 不翻译的部份只占217 5375 占4 H基因和A基因之间67个碱基 包括RNA聚合酶结合位点 转录的终止信号及核糖体结合位点等基因表达的控制区G4DNA中不翻译的部份占282 5577乳头瘤病毒基因组DNA中不翻译的部份占1 0 8 0Kb 第一节病毒的类型及其侵染相关基因 5 病毒基因组中功能相关的基因往往集中在一个或几个特定的部位 形成一个功能单位或转录单元它们可被一起转录成为含有多个mRNA的分子 称为多顺反子 polycistronie mRNA X174 基因组中的D E J F G H基因转录在同一mRNA中 然后再翻译成各种蛋白质 其中 FG及H都是编码外壳蛋白的 D蛋白与病毒的装配有关 E蛋白负责细菌的裂解 它们在功能上也是相关的腺病毒 晚期基因编码病毒的12种外壳蛋白 在晚期基因转录时是在一个启动子的作用下生成多顺反子mRNA 然后再加工成各种mRNA 第一节病毒的类型及其侵染相关基因 6 噬菌体 细菌病毒 的基因是连续的 特别是多数RNA病毒的基因组是由连续的RNA链组成 而真核细胞病毒 正链RNA病毒除外 的基因是不连续的 具有内含子 有些真核病毒的内含子或其中的一部分 对某一个基因来说是内含子 而对另一个基因却是外显子有些病毒的基因组RNA是节段性的 由不连续的几条链组成 流感病毒的基因组由8条ssRNA分子构成 每条RNA分子都可编码蛋白质 呼肠孤病毒的基因组含10条dsRNA 每条RNA分子都编码1 2种蛋白质 第一节病毒的类型及其侵染相关基因 7 除了反转录病毒基因组有两个拷贝外 所有病毒基因组都是单倍体 即每个基因在病毒颗粒中只出现一次 第一节病毒的类型及其侵染相关基因 二 病毒的类型1 DNA病毒dsDNA病毒ssDNA病毒2 RNA病毒dsRNA病毒 ssRNA病毒 ssRNA病毒3 DNARNA反转录病毒 第一节病毒的类型及其侵染相关基因 第一节病毒的类型及其侵染相关基因 第一节病毒的类型及其侵染相关基因 1 dsDNAVirus多为动物病毒和噬菌体SV40 腺病毒 噬菌体和T4噬菌体等半保留方式进行复制 但复制的场所及具体过程有所不同 第一节病毒的类型及其侵染相关基因 dsDNAviruses VirusesofhigheranimalsPoxviruses 痘病毒 Herpesviruses 疱疹病毒 Adenoviruses 腺病毒 Papovaviridae 乳多空病毒科 VirusesofinsectsBaculoviruses 杆状病毒 Iridoviruses 虹彩病毒 andPolydnaviridae 多态DNA病毒科 Virusesofeukaryoticalgae 真核藻类 藻类DNA病毒科 Phycodnaviridae VirusesofPlantCammeliayellowCYMoV鸭跖草黄斑驳病毒Cauliflowermosaic CaMV花椰菜花叶病毒 第一节病毒的类型及其侵染相关基因 2 ssDNAVirus基因组一般较3 0 6 0kb 多数对于寄主细胞的依赖 如细小病毒科 微小噬菌体科 X174 联体 双 病毒科 复制在细胞核内进行 通过合成一条负链为模板合成正链Maizestreak MSV玉米条斑病毒Beetcuritop BCTV甜菜曲顶病毒Beangoldenmosaic BGMV菜豆金黄花叶病毒Bananaburshtop BaBTV香蕉束顶病毒 第一节病毒的类型及其侵染相关基因 X174基因组约5 4kb 环状 编码10 12种蛋白 其中三个为重叠基因 B AK A CE D 有三个启动子 结构与E coli的启动子相似复制过程中单链DNA形成双 RF 超螺旋ds环状和松弛ds环状 有 复制叉 和 滚环 两种过程 第一节病毒的类型及其侵染相关基因 3 dsRNAVirus以呼肠孤病毒 Reoviruses 为代表 球形粒子 双生衣壳 基因组16 30kbp 分为10 12个节段 长度不等 呼肠孤病毒10 12个片段 囊状噬菌体3个片段 多为单顺反子 5 3 末端序列保守正链RNA5 端为 帽子 结构 3 末端为polyA尾序病毒颗粒核心含有RNA聚合酶 在酸化作用下病毒部分脱壳 形成亚颗粒 ParticleSubviral 在亚颗粒中 以负链为模板产生单顺反子RNA mRNA 并表达各种蛋白 在侵染过程后期方以正意链 mRNA 为模板合成负链 并形成双 以全保留方式在寄主细胞质中进行复制 第一节病毒的类型及其侵染相关基因 植物呼肠孤病毒 Plantreovirus 为水稻黑条矮缩病毒 斐济病毒属 Fijivirus RBSDV 和玉米粗缩病毒 MRDV Whitecloverlatent WCMV白三叶草潜隐病毒Sugarcanefiji SFV甘蔗菲济病毒哺乳动物正呼肠孤病毒 Mammalianorthoreovirus 水生呼肠孤病毒A型 AquareovirusA 第一节病毒的类型及其侵染相关基因 4 ss RNAVirus基因组多在10kb以下 以单组分或多组分存在 SARSvirus 29kb 包含病毒种类最多 约占病毒总数的70 以上 RNA可直接翻译 裸露的RNA具有侵染性 基因组RNA可作为mRNA 在侵入寄主细胞后可立即翻译产生蛋白质 组成及结构简单 多为杆状或球状粒子复制因病毒基因组结构不同存在极大的差异 病毒RNA的末端结构具有特异性 第一节病毒的类型及其侵染相关基因 病毒RNA的末端结构5 末端 原核生物病毒多为焦磷酸或三磷酸核苷残基 真核生物病毒多含有7 甲基化Vpg的鸟嘌呤核苷 帽子 Vpg ViralGenomeAssociatedProtein 的小分子蛋白 2 520kDa 经常存在于以多肽蛋白为最初翻译产物的基因组RNA中 3 末端 多数RNA病毒具有高度有序的3 末端二级结构 如一些真核生物病毒中的tRNA结构及一些病毒中的PolyA尾序 第一节病毒的类型及其侵染相关基因 第一节病毒的类型及其侵染相关基因 第一节病毒的类型及其侵染相关基因 第一节病毒的类型及其侵染相关基因 第一节病毒的类型及其侵染相关基因 第一节病毒的类型及其侵染相关基因 5 ss RNAVirus基因组主要特征 负链RNA基因组 病毒RNA转录产生正链mRNA裸露的RNA不具有侵染性 基因组分离或否 均具有包膜 粒子中多含有RdRp RNA dependentRNApolymerase 以病毒粒子携带的RdRp起始转录过程 产生单顺反子mRNA 第一节病毒的类型及其侵染相关基因 弹状病毒 Rhabdovirus 既可感染动物 又可感染植物 如水泡性口膜炎病坏死黄化病毒 基 线形 11 15kb 通常为负意5个以上基因 每个基因都有独立的转录起始序列和终止序列 转录终止序列末端PolyA加尾信号 TAATAAAA 3 末端的Leader区与5 末端的Trailer区互补程度较高 锅柄 状结构LT 与区域的互补负意链序列 RV3UGCGAAUUGUUGUUUUGGUCUCUUCUUUUU 5ACGCUUAACAAAUAAACAACAAAAAUGAGA LNYV3AAUGCCUGUUAUUAUCUUCUUUUUUUAGUUCA5 ACGGACGAUAAUAAAAUCAAAAAGUCCAAU 第一节病毒的类型及其侵染相关基因 第一节病毒的类型及其侵染相关基因 第一节病毒的类型及其侵染相关基因 第一节病毒的类型及其侵染相关基因 RNA DNA逆转录病毒 第一节病毒的类型及其侵染相关基因 第一节病毒的类型及其侵染相关基因 第一节病毒的类型及其侵染相关基因 第一节病毒的类型及其侵染相关基因 7 与病毒类似的亚病毒 subvirus A 类病毒 Viroids 为目前已知最小的独立侵染核酸分子 由Diener在1971年首次发现 马铃薯纺锤形块茎类病毒PSTVd 主要存在于植物寄主中单链环状RNA分子 无外壳蛋白 核苷酸长度为246 375nt 富含G C 53 60 环状分子高度碱基配对 外形呈杆状 在寄主植物中可自我复制 第一节病毒的类型及其侵染相关基因 已经发现的类病毒已超过30种 根据序列和结构的同源性 复制特性分为两个组 分别为马铃薯纺锤块茎类病毒组 PSTVd 和鳄梨日斑类病毒组 ASBVd B 朊病毒 Prions 一类仅含有蛋白质的侵染性病原物 导致动物或人类中枢神经系统的慢性病变 并可以 遗传 例如疯牛病 madcow 羊骚痒病 scrapie 人G S综合症 老年痴 C J病 振颤病 海绵状脑硬化 等疯牛病是由一种Prion侵染引起的 它也可以感染人而引起神经系统疾病Prion是正常神经活动所需要的蛋白质 而致病Prion与正常Prion的一级结构完全相同 只是空间结构 折叠状态 不同 第一节病毒的类型及其侵染相关基因 三 病毒侵染的相关基因 第一节病毒的类型及其侵染相关基因 第一节病毒的类型及其侵染相关基因 噬菌体主要的调节元件及调节基因产物的功能PL OL PR OR左右向转录的启动子和操纵子tR 1 2 3 4 5 右向转录的终止子tL 1 2 左向转录的终止子PREC 蛋白建立启动子 受C 蛋白调控PIInt基因启动子 受C 蛋白调控PaQQ蛋白反义RNA启动子 受C 蛋白调控PRMC 蛋白基因维持启动子 受C 浓度调控PR 晚期转录的启动子nutL nutRN蛋白左右两个反终止结合位点qutQ蛋白反终止结合位点croPL和PR的阻遏蛋白 并可阻遏PE 抑制CI表达 第一节病毒的类型及其侵染相关基因 cIPL和PR的主要的阻遏物 并可自主调控PRMc 可以启动PRE PI和PAQ 使 进入溶原化途径c 和C 组成复合物 启动PE产生c 及cro的反义RNANtR1 tR2及tL1的反终止蛋白QtR4的反终止蛋白 O PDNA复制所需的蛋白S R R2裂解宿主所需的裂解酶Int整合酶 使 整合到宿主的染色体中Xis切除酶 帮助 在att位点和宿主连接bet exo重组蛋白 帮助 和宿主进行重组W B Nu3 C D E F F Z头部蛋白基因U V G T H M L K I J尾部蛋白基因cos12bp的回文序列 由线状连接成环状的连接点A蛋白切割位点A末端酶 识别cos位点 第一节病毒的类型及其侵染相关基因 四 噬菌体的基因组及早 晚期转录 第一节病毒的类型及其侵染相关基因 ThelGenome 噬菌体基因组长48502nt 共61个基因 其中32个较为重要 噬菌体提供了最为复杂的级联调控 在它发育中有两个可调控阶段 溶原化周期和裂解周期 这两个周期相互连系 DNA进入新的宿主细胞时裂解和溶原化的途径并存 早早期和晚早期的基因都需要表达 然后分化 若晚期基因得到表达那么就向裂解途径发育 若阻遏物CI蛋白合成了 就要进入溶原化途径 噬菌体的调控有多种形式 有正调节 负调节 自主性的反馈调节 抗终止调节 反义调节及反向调节 第一节病毒的类型及其侵染相关基因 CI蛋白是 噬菌体的阻遏蛋白 由两个亚基组成 每个亚基都有两个功能区 N端与操纵基因结合 C端具有相互结合成二聚体的能力 CI蛋白的二聚体与二聚体之间有协同效应 Cro蛋白也是一种阻遏蛋白 以二聚体的形式与操纵基因结合 但Cro最易和OR3结合 而CI最容易与OR1 OR2结合 Cro无协同效应 C 蛋白能激活cI的建立溶原化启动子PRE 整合酶启动子PI以及反终止蛋白Q的反义RNA动子PAQ 这些启动子的激活却对溶原化有利 第一节病毒的类型及其侵染相关基因 第一节病毒的类型及其侵染相关基因 1早早期基因 只有两个 cro和N 由宿主的RNA聚合酶转录 N编码一种反终止蛋白 它作用于nut Nutilization 位点 使早早期转录不会在tR1和tL1处终止而进成一步转录晚早期的一些基因 Cro controlofrepressorandotherthings 具有双重功能 它既可阻止CI蛋白的合成 又可以关闭早期基因的表达 第一节病毒的类型及其侵染相关基因 2晚早期基因包括2个复制基因 裂解感染所需的 7个重组基因及3个调节基因 cII cIII Q 7个重组基因中 有的和裂解感染中的重组有关 其中有2个是 DNA整合到细菌染色体中所必需的C 和CIII的复合物可启动PE启动子 对于阻遏物CI的开始合成是必要的 而Q蛋白也是一个反终止蛋白 它使宿主的RNA聚合酶不是在终止子tR3处终止 而继续合成晚期基因 因此我们可以将晚期基因分为两类 有的是噬菌体进入溶原化途径所必须的 而另一类是控制进入裂解周期的 第一节病毒的类型及其侵染相关基因 第一节病毒的类型及其侵染相关基因 噬菌体也具有反义的mRNA调节的机制 一是PRE启动子其转录方向与cro基因的转录方向相反 其5 端和cro基因的mRNA重叠 可进行反义抑制cro的表达 二是PAQ启动子转录一段长约200b的RNA 不编码蛋白 而和抗终止蛋白Q的mRNA5 端互补 起到反义抑制的作用 不同启动子PL和PI所产生的RNA 虽序列重叠 但长度不同 形成二级结构也不同 前者的mRNA易被RNase 剪切 继而被核酸酶所降解 从而不能表达 而只有PI启动子转录的intmRNA才是稳定的可以翻译成整合酶 供溶原化时 基因组插入到宿主染色体上所需 噬菌体有2个抗终止基因N和Q 它们的产物可在一定的位置和RNA聚合酶结合 使其顺利通过早早期和晚早期转录的终止子 有利于宿主的裂解 第一节病毒的类型及其侵染相关基因 在调节基因中 有早早期基因N与cro 它们是由不同的模板继转录的 N向左 cro向右 N反终止蛋白的存在使转录持续向前进入重组基因区 向右进入复制基因区 晚期基因是作为单个的转录单位表达的 从位于Q和S之间的启动子PR 开始 此启动子是连续使用的 当Q蛋白缺乏时 晚期转录终止在tR3位点 产生了长194b的转录本 称为6SRNA 当Q蛋白存在时 它阻遏了tR3的终止和6SRNA的表达 第一节病毒的类型及其侵染相关基因 晚期的反终止的作用与N蛋白的反终止作用是相似的 pQ作用的qut Q utilization 正好位于晚期启动子的下游 RNA聚通过此处时 pQ与其作用消除了终止 第一节病毒的类型及其侵染相关基因 3 反终止作用 噬菌体从早期基因表达转换到下一期基因表达采用了一个完全不同的控制机制 反终止作用 早期基因是与下一期的基因相连接的 但二者之间有一个终止子位点 若终止作用在这个位点被阻止的话 那么RNA聚合酶就可以通读而进入另一基因 在反终止作用中 相同的启动子可以继续被RNA聚合酶所识别 因此新的基因是通过RNA的延续 形成一个长的RNA链而得到表达的 在这种的RNA中 5 端是早期基因的序列 3 端是下一期基因的序列 所以 早期基因的表达必然是连续的 第一节病毒的类型及其侵染相关基因 pN抗终止的活性是高度特异的 但抗终止这件事情本身并不取决于终止子tL1和tR1 pN作用的识别位点叫做nut Nutilization 负责左向和左向反终止位点分别是nutL和nutR 通过nut突变作图发现nutL位于PL的起始点和N编码区的起始点之间 nutR位于cro基因末端和tL1之间 这意味着两个nut位点离它们转录单位的相对距离是不同的 nutL离启动子此较近 nutR离其终止子比较近 pN识别nut位点时可使聚合酶对终止信号不理采而持续穿过 这个反应涉及到依赖 因子的终止子上产生抗终止作用 但pN也能作用于内部终止子 intrinsicterminators 第一节病毒的类型及其侵染相关基因 的nut位点含有两个序列元件 称为A盒 boxA 和B盒 boxB A盒在细菌的操纵中也有存在 它在噬菌体和细菌的操纵子中对于抗终止是必须的 B盒的序列发生突变就会消除pN产生的抗终止能力 B盒只存在于噬菌体基因组中 nut含有两个序列 核心酶通过boxA时 NusB S10和它结合 当通过boxB时NusA和pN与RNA聚合酶结合 pN的存在使RNA聚合酶通读终止子 产生含有早早期序列和晚早期序列的连续mRNA 第一节病毒的类型及其侵染相关基因 第一节病毒的类型及其侵染相关基因 和pN相互作用的蛋白质因子通过分离E coli突变体而被鉴别出来 因 感染后仅限于早期基因的表达 这一系列的突变位点都位于rpoB基因中 表明pN就像 因子一样 是和核心酶的 亚基相作用的 通过另一种阻止pN的功能的E coli的突变而鉴别出Nus因子 NusA NusB NusE和NusG 这些蛋白形成了转录装置的一部分 但却不能从RNA聚合酶中分离出来 NusA NusB和NusG的功能是和转录终止相关 NusE是核糖体蛋白S10 它在30S亚基中的位置与在终止中的功能二者并无明显的关系 pN与RNA聚合酶以及NusA NusG NusB和核糖体蛋白S10 NusE 形成紧密的复合物 它们可能通过控制延伸的动力学性质 如作为停顿抑制因子直接作用 也可能直接特异性地与终止装置作用 改变模板的结构 第一节病毒的类型及其侵染相关基因 pQ是噬菌体在感染晚期的抗终止蛋白 qut序列是pQ作用所需要的 它位于晚期转录单位的起始处 qut的上游部分位于启动中 下游部分位于转录区的起始处 这意味着pQ的作用涉及到DNA的识别 pQ的基本作用是干扰停顿 一旦pQ作用在RNA聚合酶上 这个酶就明显地在所有位点减少停顿 包括在 依赖性终止位点和内部终止位点 所以pQ并不直接地作用终止子本身 但它可以使酶急速地通过终止子 第一节病毒的类型及其侵染相关基因 第二节病毒的侵染机制 1TMV病毒侵染的过程和机制1 进入 第二节病毒的侵染机制 2 复制 第二节病毒的侵染机制 第二节病毒的侵染机制 3 移动A细胞间的移动6 13uM h大约1细胞 2Hour通过胞间连丝进行移动 需要编码蛋白RdrP136kDa MP 不需要CPB长距离运输通过维管束 1 5 8cm h 病毒粒子的整体移动 第二节病毒的侵染机制 第二节病毒的侵染机制 第二节病毒的侵染机制 第二节病毒的侵染机制 第二节病毒的侵染机制 二病毒的侵染机制中的转录形式 第二节病毒的侵染机制 第二节病毒的侵染机制 甜菜黑色焦枯病毒 Beetblackscorchvirus BBSV 第二节病毒的侵染机制 第二节病毒的侵染机制 第二节病毒的侵染机制 第二节病毒的侵染机制 第三节病毒与受体的基因互作 植物病毒介体传播的机制和基因互作植物病毒47个属中 被证实可通过天然生物媒介传播的病毒有40个属 植物病毒经空气传播 air borne 的介体是昆虫和螨 而经土壤传播 soil borne 的介体为线虫和真菌 此外 植物病毒传播还可通过寄主植物的种子 seed borne 和花粉 pollen borne 传播 在昆虫传播的介导方式中 马铃薯Y病毒属 Potyvirus 在自然界由蚜虫以非持续性方式传播 研究表明两个由病毒编码的蛋白与介体传播有关 一个是外壳蛋白 Coatprotein CP 另一个为辅助因子 Helpercomponentprotease HC Pro 1 外壳蛋白 CP 现已知道PVYCP的N端暴露表面的氨基酸三联子Asp Ala Gly DAGbox 保守区对蚜虫传播是必须的 并推测其为HC相互作用的功能区 烟草脉斑驳病毒 Tobaccoveinmottlingvirus TVMV 和西葫芦黄花叶病毒 Zucchiniyellowmosaicvirus ZYMV 的CP基因突变分析 进一步明确DAG三联子在蚜虫传播中的作用 在TVMVCP中 这三个氨基酸任何一个缺失或替换 均能导致蚜虫传播特性明显下降或完全丧失 第一位氨基酸是酸性或中性氨基酸 Asp或Asn 而不是碱性氨基酸有传播性 第二位为一个小的非极性残基 Ala 对传播是必须的 残基变大或极性增强对传播均产生负面的影响 第三位的甘氨酸 Gly 是影响传播的关键 变为任何其它氨基酸 即使是小残基的氨基酸如Ala 均能导致虫传性的丧失 第三节病毒与受体的基因互作 2 辅助蛋白 HC Pro 体外实验证明 纯化的TEV病毒粒子只能被那些预先用含有PVYHC因子的汁液饲养过的蚜虫传播 而用健康植物汁液预先饲养的蚜虫 却不能传毒 即使先饲毒而后再获取HC因子也不能传毒将PVY的一个非蚜虫传播的HC缺陷株 称为PVC 与野生的PVY进行比较后发现 非虫传播PVC并不是缺失HC蛋白 比较突变体HC基因的核苷酸序列有92 一致 但是有24个核苷酸 进一步比较其相应的氨基酸序列 发现只有2个氨基酸被替换 即Lys50 Glu Ile225 Val 用点突变的方法证明了TVMVHCN端的Lys51 Glu改变 导致了蚜虫传播性的丢失 而与Ile226 Val无关系 Lys51被大部分氨基酸替代后均失去虫传活性 但对Arg替代却是允许的 此外 HCN端的His Cys保守残基的改变 不仅影响虫传活性 有些甚至导致病毒失活 第三节病