地龙脱氧核糖核酸酶的部分性质研究及作用初探

1 / 9地龙脱氧核糖核酸酶的部分性质研究及作用初探作者：樊慧杰康慧芳姚建强王晓媛杨利军牛勃【摘要】 ：目的 研究地龙体内两种新型脱氧核糖核酸酶(LDs)的部分生化性质,并对其作用进行初步探索。方法 采用 Sephacryl-200 柱层析、毛细管等电聚焦电泳法、琼脂糖凝胶电泳等方法。结果 初步得出 LD1、LD2 分子量为 126、62 kDa；确定了等电点分别为、 。LD1、LD2 对细菌质粒 DNA、DNA 均有分解作用。结论 地龙中的 LDs 是一种新型的脱氧核糖核酸酶。明确 LDs 的分子量、等电点有助于优化 LDs 的提取工艺以及 LDs 的进一步研究。对细菌质粒 DNA、DNA 的降解提示 LDs 有可能对抗细菌的耐药性。【关键词】 地龙脱氧核糖核酸酶分子量等电点Abstract：Objective To study partial biochemical characterization and effect of lumbricus dornases (LDs). Methods Sephacryl-200 column chromatography, CIEF and agarose electrophoresis were used to determine LDs. Results 2 / 9The molecular weights of LD1 and LD2 were 126 kDa and 62 kDa respectively. The pI of LD1 and LD2 were and LDs degraded bacterial plasmid and DNA. Conclusion LDs is a new kind of dornases. The determination of molecular weights and pI of LDs will help their further study. The results of plasmid and DNA degradation imply that LDs can oppose bacteria drug resistance.Key words：lumbricus；dornases；molecular weight；pI地龙,又名蚯蚓,属无脊椎动物,环节动物门,寡毛纲。地龙性寒味咸,功能清热平肝、熄风止痉、平喘、利尿、通络除痹。主治高热烦躁、惊厥抽搐、肺热喘咳、热结尿闭以及疮疡脓毒等症。国内外研究已发现,蚯蚓体内有溶栓酶、蚓激酶、胆碱酯酶、过氧化氢酶1、溶菌酶2、Lysenin3等有效成分。作为有 4 000 余年药用历史的地龙,对其开发利用还是远远不够。本课题组致力于地龙的研究,从地龙中分离纯化出脱氧核糖核酸酶样的物质(LDs)。本实验主要研究 LDs 分子量、等电点,并对其作用进行初步探索。证实 LDs 为新型的脱氧核糖核酸酶,具有不同的性质。同时为 LDs 的研究开发提供可靠的实验依据。3 / 91 实验材料样品与试剂分离、纯化的 LD1、LD2。蓝色葡聚糖 2000(Blue dextran- 2000),Pharmacia；Coomassie Brilliant Blue G250, Fluka；毛细管等电聚焦试剂盒(cIEF3-10 Kit)；质粒(pBV220),由本实验室自备；DNA,Sigma 公司产品。其它所用试剂均为分析纯。主要仪器Gradifrac 层析系统,pharamacia 公司；毛细管电泳仪：BECKMAN 55002。2 实验方法分子量测定凝胶过滤层析(分子筛)法：参照文献4方法。等电点测定毛细管等电聚焦电泳法：参照文献5方法。4 / 9LDs 对质粒的降解作用取 3 L 质粒(pBV220),分别加入 LD1、LD2 10 L,37 反应 30 min 后进行% 琼脂糖凝胶电泳,EB 染色后分析结果。LDs 对 DNA 的降解作用取 2 LDNA,分别加入 LD1、LD2 10 L,37 反应 30 min 后进行% 琼脂糖凝胶电泳,EB 染色后分析结果。3 结果凝胶过滤层析(分子筛)测定 LDs 分子量以标准蛋白质洗脱体积为纵坐标,标准蛋白质分子量的对数为横坐标,绘制标准曲线。根据 LD1、LD2 的洗脱体积,查标准曲线,并计算出用 Sephacryl S-200 测得LD1、LD2 分子量分别为 126、62 kDa。LDs 等电点的测定结果毛细管等电聚焦法测定等电点的结果：LD1、LD2等电点分别为、 。5 / 9LDs 对质粒(pBV220)的降解作用(见图 1)LD1、LD2 与质粒作用 30 min 后电泳,EB 染色观察,LD1、LD2 彻底降解了质粒。倍比稀释的 LD1、LD2 分解质粒的作用减弱,可以看到仍有微弱的质粒条带出现。LDs 对质粒有明显的降解作用,从图 1 中看不出 LD1、LD2 对质粒的降解作用有明显的差别。LDs 对 DNA 的降解作用(见图 2)LDs 与 DNA 作用 30 min 后进行% 琼脂糖凝胶电泳,EB 染色后分析结果。LD1、LD2 作用后的 DNA 条带减弱,图 2 的下方有云雾状的阴影,为 DNA 的降解产物。说明LD1、LD2 有降解 DNA 的作用。图 2 中看不出 LD1、LD2对 DNA 降解作用有明显的差别。4 讨论脱氧核糖核酸酶(DNase)已在不同的物种中发现,目6 / 9前针对其研究较多的是 DNase、DNase。DNase是Sachs61905 年首次在牛胰腺中发现,现对 DNase的研究已扩展到人、鸡、鼠、犬及鲤鱼等动物。已纯化出不同来源的 DNase的分子量在 3241 kDa 范围之间,等电点在之间。DNase存在于各种哺乳动物的组织中7,尽管来自各种不同种属和组织的 DNase的化学性质并不完全一样(如分子量、亚基结构),但这些酶的酶学性质非常相似。迄今已纯化出不同来源的 DNase的分子量范围在45 kDa之间。我们发现的 LD1、LD2 分子量为 126、62 kDa；等电点为、 。LDs 与 DNase、DNase分子量有很大差别,分子量远远大于 DNase、DNase；LDs 的等电点也明显不同于 DNase。可以推测,LDs 是新型的脱氧核糖核酸酶,具有不同的性质。质粒是细菌染色体以外能自主复制的,双链共价闭合环状 DNA。细菌对药物产生抗性,原因多种。现在研究的热点是耐药性质粒(其携带耐药基因),质粒可以从一个细菌进入另一个细菌,耐药基因也从一个细菌传到另一个细菌,致细菌耐药性的广泛产生。噬菌体是感染细菌的一类病毒,有的噬菌体基因组较大,如 噬菌体和 T 噬菌体。 噬菌体由外壳蛋白和 DNA(线状双链 DNA 分子)组成。通过溶原性7 / 9方式 DNA 能整合到细菌染色体 DNA 中,与 DNA 相毗邻的细菌基因有可能被噬菌体从一个细胞转移到另一个细胞(即转导),使遗传性状在不同细菌个体间传播。本实验表明,LDs 能降解耐药质粒和 DNA,推测 LDs 有可能阻断细菌遗传形状的改变(如细菌的耐药性)。LDs 彻底降解了质粒,同样条件下对 DNA 是部分分解。DNA 为 48 502 bp,远远大于质粒(pBV220：3 665 bp),LDs 降解 DNA 较质粒会困难些。在临床上重组人 DNase(rhDNase)已用于治疗支气管扩张、肺脓疡等。现认为重组人 DNase 可以分解黏液中的 DNA,减轻炎症从而发挥作用8。提示作为一种新脱氧核糖核酸酶的 LDs 同样有可能对抗炎症,起到治疗作用。LDs 是新蛋白质,是蚯蚓开发的新思路。本实验研究了 LDs 的部分性质,为 LDs 的深入实验及开发利用做了铺垫。LDs 的研究可以为地龙治疗肺热喘咳、热结尿闭以及疮疡脓毒等症提供理论依据。3 Kobayashi H, Ohta N, Umeda M. Biology of lysenin, a protein in the coelomic fluid of the 8 / 9earthworm eisenia foetidaJ. International Review of Cytology,XX,236：4599.4 李建武,萧能赓,余瑞元,等.生物化学实验原理和方法M.北京：北京大学出版社,211.5 郭尧君.蛋白质电泳技术M.第 2 版.北京：科学出版社,132.6 Napirei M, Ricken A, Eulitz D, et al. Expression pattern of the deoxyribonuclease 1 gene：lessons from the DNase1 knockout mouseJ. Biochem J,XX,380(Pt 3)：929937.7 Yasuda T, Nadano D, Awazu S, et al. Human urine deoxyribonuclease (DNase ) isoenzymes：a novel immunoaffinity purification, biochemical multiplicity, genetic heterogeneity and broad 9 / 9distribution among tissues and body flui