流式细胞仪的应用

流式细胞仪的应用 姓名 学号 2002015002 单位 研究生二队 专业 病理学与病理生理学 对于一个毕业以后就从来没有进过实验室使用过各种尖端仪器 的研究生来说 仪器分析这个课程对我来说显而易见是重要而又陌 生的 就像一个小孩到了游乐园一样 每一种仪器都很吸引我 好 奇心也驱使我特别想尽快操作一下这些仪器 唯一的遗憾是本课程 课时太少 不能把中心实验室的所有仪器都了解一遍 12 月 4 号学 习了流式细胞仪的原理与基本应用方法 虽然没有操作过 但是我 想对我在本次课上的所学的内容做一下总结并谈谈对流式细胞仪的 粗浅认识 由于没有实际基础 不对的地方请老师多多谅解并纠正 流式细胞仪 流式细胞仪 Flow cytometry 是对细胞进行分选和快速测的仪器 它可以将分散在液体中的各个细胞的物理性质 生物化学特征等参 数进行快速测量并根据所得参数范围对目的细胞进行分选并存贮 这些参数可以包括每一个细胞的体积 细胞凋亡及所包含的可标记 的蛋白质或者核酸的快速定量等 与传统的细胞测量方法 免疫荧 光和免疫印迹 相比 其优缺点可总结如下表 流式细胞仪免疫荧光免疫印迹 优点 1 明确阳性细胞比 例 2 同时检测多种蛋 白表达 3 蛋白定量容易 4 速度快 灵敏度 高 5 阳性细胞的 相对数量 6 明确组织和细 胞内定为 1 检测整体 表达情况 2 蛋白定量 较容易 缺点不能在组织和细胞 内定位 1 蛋白定量困难 2 仅检测局部表 达情况 1 不能组织或细 胞内定位 2 不能确定阳性 细胞比例 由上表可以看出 与传统的细胞检测方法相比 流式细胞仪具 有无可比拟的技术优势和应用前景 甚至可以说流失细胞术完全能 够推动医学科研的发展 是一个伟大的发明 流式细胞仪的原理流式细胞仪的原理 将待测的细胞样品制作成单个细胞的混悬 液 根据实验目的对需要检测和分选的细胞进行特异性荧光染色并 放入样品管 在清洁气体的压力下进入流动室 流动室内含有鞘液 鞘液可以约束样品使之处在喷嘴中心以提高测量精度 并防止样品 靠近喷孔壁以导致堵塞 在这种作用下细胞排成单列一个一个地在 鞘液包裹下被喷嘴喷出形成液体流柱 流柱流经高度聚焦的激光束 时被特异染色的细胞被激发而产生特异性荧光 荧光被检测系统检 测并转变成电信号进入计算机分析系统而得到细胞的物理 生物特 性 流式细胞仪的分选功能是由细胞分选器来完成的 由喷嘴射出 的液柱被分割成一连串的小水滴 根据选定的某个参数由逻辑电路 判明是否将被分选 而后由充电电路对选定细胞液滴充电 带电液 滴携带细胞通过静电场而发生偏转 落入收集器中 其它液体被当 作废液抽吸掉 通过原理我们也可以很容易的得到流式细胞仪的基本结构和功 能 1 液流系统 流动室由样品管 鞘液管和喷嘴等组成 常用光 学玻璃 石英等透明 稳定的材料制作 设计和制作均很精细 是 液流系统的心脏 样品管贮放样品 单个细胞悬液在液流压力作用 下从样品管射出 鞘液由鞘液管从四周流向喷孔 包围在样品外周 后从喷嘴射出 为了保证液流是稳液 一般限制液流速度 10m s 由于鞘液的作用 被检测细胞被限制在液流的轴线上 流动室上装有压电晶体 受到振荡信号可发生振动 2 激光系统 经特异荧光染色的细胞需要合适的光源照射激发 才能发出荧光供收集检测 激光器又以氩离子激光器为普遍 光源 的选择主要根据被激发物质的激发光谱而定 3 检测系统 经荧光染色的细胞受合适的光激发后所产生的荧 光是通过光电转换器转变成电信号而进行测量的 由于直接激发的 光比较弱 对弱光测量光电倍增管 4 计算机分析系统 经放大后的电信号被送往计算机分析器进 行数据处理和分析 最后给出结果 流式细胞仪主要细胞参数 流式细胞仪主要细胞参数 1 前向角散射 FSC FSC 的强度与细胞大小有关 也就是 说 同一个细胞样本中 FSC 强的其细胞要大一些 而 FSC 弱的其 细胞要小一些 2 侧向角散射 SSC SSC 对细胞膜 胞质 核膜的折射率 更为敏感 对胞内较大的颗粒也有反应 所以 SSC 的强弱可以反应 细胞内精细结构和颗粒的性质 3 荧光强度 FL 是细胞或细胞上的荧光染料被激光激发后 发射出来的光的强度 不同的荧光染料其发射波长不同 通过荧光 强度可将同一个细胞群体中的有荧光标记的细胞和无荧光标记的细 胞区分开来 即阳性细胞的分选 根据 FL 强度的不同可以将强阳性 细胞和弱阳性细胞分选开来 流式细胞术的应用流式细胞术的应用 1 细胞 DNA 含量检测 细胞固定后用碘化丙啶 PI 染色 因 为 PI 能特异性结合于 DNA 荧光强度与 PI 的结合量呈良好的线性 关系 根据这个原理可以检测出 DNA 的含量 可用于细胞周期 细 胞倍体及凋亡的检测 凋亡的检测 凋亡的检测 在正常细胞中 磷脂酰丝氨酸 PS 只分布在细胞膜脂质双层的内侧 而在细胞凋亡早期 细胞 膜中的 PS 由脂膜内侧翻向外侧 Annexin V 是一种分子量为 35 36kD 的 Ca2 依赖性磷脂结合蛋白 与 PS 有高度亲和力 故可通 过细胞外侧暴露的 与凋亡早期细胞的胞膜结合 因此 Annexin V 被作为检测细胞早期凋亡的灵敏指标之一 将 Annexin V 进行荧 光素 EGFP FITC 标记 以标记了的 Annexin V 作为荧光探针 利用荧光显微镜或流式细胞仪可检测细胞凋亡的发生 碘化丙啶 PI 是一种核酸染料 它不能透过完整的细胞膜 但对凋亡中晚 期的细胞和死细胞 PI 能够透过细胞膜而使细胞核染红 因此将 Annexin V 与 PI 匹配使用 就可以将处于不同凋亡时期的细胞区分 开来 2 肿瘤的诊断 DNA 异倍体的出现是肿瘤的一个重要标志 细 胞的增值能力大小也可以反映肿瘤的生物学特征 因此可以利用流 式细胞仪进行细胞周期分析和 DNA 倍性分析 辅助进行肿瘤的诊断 3 细胞表型分析 细胞表型分析得益于单克隆抗体的产生及发 展 细胞用带有荧光的单克隆抗体标记以后 用流式细胞仪可以对 其进行检测分析 可以分析出荧光细胞的含量及这种阳性细胞的 分子的相对含量 白血病的免疫分型测定 利用免疫荧光标记 的单克隆抗体分子做探针 多参数分析白血病细胞膜 细胞浆和细 胞核的免疫表型 由此了解被测白血病细胞所属细胞系及其分化程 度 细胞系的鉴定 新建立的细胞系 通过流式细胞术进行系 列表型分析 由此确定此细胞系的表型 已建立表型的细胞系 通 过流式细胞术再次进行分析 以检验多次传代和培养后该细胞系是 否有变异 流式细胞仪在医学领域中有广泛的应用前景 凡是能被荧光素 标记且这种荧光素能被流失细胞仪所配置的激光光源激发的细胞或 颗粒都可以用流式细胞仪检测 在生物检测中是一台超能力的机器 流式细胞术的发明 改进 流式细胞仪的研制 改进的每一步都凝 聚了人类最新的科技和智慧 凝聚了生物