PEG6000沉淀结合差速离心方法浓缩水中脊髓灰质炎病毒

PEG6000PEG6000 沉淀结合差速离心方法浓缩水中脊髓灰质炎病沉淀结合差速离心方法浓缩水中脊髓灰质炎病 毒毒 文章来源 文章来源 2006 7 18 18 54 14 PEG6000 沉淀结合差速离心方法浓缩水中脊髓灰质炎病毒 第四军医大学学报 2000 年第 21 卷第 1 期 张文清 马文煜 骆文静 姜绍谆 胡艳冰 侯悦 张进 于碧云 摘摘 要 目的要 目的 建立一种简便 有效的从细胞培养物中纯化 PV1 病毒的方法用于水病毒消毒 实验 方法方法 PV 1 Henan 株在 Hep 2 细胞中增殖后用聚乙二醇 PEG 6000 沉淀结合差速离心的方 法纯化病毒 rT PCR 和透射电镜 TEM 鉴定提纯病毒的形态学和分子生物学特性 结果结果 pH 值 7 5 时终浓度 70 g L 1的 PEG6000 沉淀病毒的感染性回收率 PFU 计数 为 79 2 提纯系数 PF 为 106 再经差速离心 16000 g 30 min 100 000 g 4 5 h 浓缩病毒的感染性回性率和提纯系 数分别为 29 0 和 168 rT PCR 和 TEM 最终鉴定提纯物为 PV 1 Henan 株 结论结论 PEG6000 结合差 速离心的方法较之蔗糖密度梯度区带离心方法易于操作 且比单独 PEG 沉淀有更高的纯化系数 是一种简便 有效的方法 关键词 关键词 脊髓灰质炎病毒 病毒分离与纯化 聚乙二醇 离心法 0 0 引言引言 影响水中病毒消毒效果的因素很多 除了病毒的生物学特性 消毒剂的性质与剂量以及环境 温度外 还有水中病毒聚集性 水质酸碱度 离子强度以及病毒周围有机物等 1 包绕在病毒周 围的有机物 尤其是蛋白类 不仅为病毒提供物理屏障 使消毒剂不易穿透至作用靶点 而且有 机物中许多化学基团如巯基还可与氧化性消毒剂产生反应 导致消毒剂有效浓度大为降低 emetson 等 2 报告 臭氧灭活 Hep 2 细胞中的 PV 和 Coxs 病毒需要的消毒剂浓时积 CT 值 较 灭活游离于细胞外的这两种病毒高约 150 倍 因此在人工制备病毒污染水样时要经过反复冻融感 染细胞 超声粉碎 低速离心沉淀细胞碎片以及其它特殊沉淀病毒蛋白 离心提纯病毒的过程 我们采用反复冻融 超声粉碎 低速离心以去除细胞碎片 并进一步用 PEG6000 沉淀病毒蛋白 差速离心提纯 PV1 病毒 1 1 材料和方法材料和方法 1 1 材料 电子显微镜 JEM 2000EX 型 日本电子公司 高速冷冻离心机 GL 20A 型 湘 西仪器仪表厂 超速离心机 Centrikont 2080 型 瑞士 Kontron 公司 病毒株与细胞株 3 PEG 6000 日本进口 天津天秦公司分装 1 2 方法 细胞培养与病毒感染按我们先前的方法 3 接种病毒 3 5 d 出现严重 CPE 后反复冻融细胞 5 6 次 再经超声粉碎至细胞完全裂解 病毒原液 S0 在 4 环境 经 4000 r min 1离心 30 min 后弃沉淀 P1 留上清 S1 冻存备用 PEG 沉淀 在 S1中缓慢滴加 400 g L 1 PEG 6000 溶液至 PEG 终浓度为 70 g L 1 并随时搅拌 调整 pH 至 7 5 4 过夜后 8000 r min 1离心 30 min 后弃上清 S2 留沉淀 P2 差速离心 用 0 01 mol L 1 pH 7 4 的 PBS 混悬 P2后 4 12 000 r min 1 16 000 g 离心 30 min 后弃沉淀 P3 上清 S3 再经 PBS 混 悬 4 38 000 r min 1 100 000 g 超速离心 4 5 h 弃上清 S4 沉淀 P4 混悬后冰浴条件下 14 mm 振幅超声粉碎 2 min 加双抗处理后用灭菌双蒸去离子水稀释 75 冻存 蛋白质浓度测 定 按 Lowry 方法 病毒感染性测定 采用改良的蚀斑试验 3 RT PCR 详见我们先前的实验 4 TEM 鉴定 30 mL L 1戊二醛和 10 g L 1饿酸双固定 P4中病毒 按常规电镜制作程序用 Epon812 dDSA DMP 30 混合液制备包埋块 超薄切片后用醋酸铀和枸橡酸铝染色 透射电镜下 观察照相 2 2 结果结果 2 1 细胞培养物处理效果 细胞冻融 粉碎后低速离心可去除绝大部分细胞碎片 P1 由 Tab1 可见 离心降低 25 的蛋白 但病毒的感染性仅下降 15 8 表 1 从细胞培养物中提纯 PV1 病毒结果 tab 1 The results of purification of PV 1 from cell cultures ProteinVirus infectivitySample No V mL g L 1 RecoveryPFU L RecoveryPFU gPFa S016006 24100 002 80 108100 00 49 1081 00 S115844 7375 002 38 10884 20 50 1081 01 P1Discarded S2Discarded2 80 5 54 106 P240b1 710 698 87 10979 25 19 109106 00 S3380 870 335 02 10942 65 77 109118 00 P3Discarded S4Discarded 2 37 107 P424b0 660 165 42 10929 08 21 109168 00 a PF Purify coefficient S1 S4 or P1 P4 PFU mg protein S0 PFU mg protein b Volume of pellets suspended with PBS buffer s0 Primary virus solution S1 S2 S3 S4 supernate after first second third and fourth centrifugation respectively P1 P2 P3 P4 precipitation after first second third and fourth centrifugation respectively 2 2 PEG 6000 沉淀病毒蛋白 作用 PEG 处理后的沉淀物 P2能保留 79 2 的病毒感染性 同时去除 99 1 非病毒蛋白 从而使 提纯系数达到 106 Tab 1 2 3 差速离心提纯沉淀病毒的作用 经一次高速和一次超速离心后可除去 P2中约 50 的小 分子杂蛋白 而感染性回收率分别为 42 6 和 29 0 提纯系数分别为 116 和 168 Tab 1 2 4 RT PCR 及 TEM 鉴定结果 提取物 P4 电镜检查可见密集分布的直径约 30 nm 呈对称 颗粒球形的病毒 Fig 1 与文献一致 而提纯前细胞内质网中见有散在的病毒颗粒 Fig2 RT PCR 扩增后电泳可见一个 214 bp 特异片断 与阳性对照相同 图 1 纯化后沉淀物 PV1 透射电镜鉴定结果 fig 1 TEM photograph of poliovirus type 1 henan strain after purification 20000 图 2 纯化前感染细胞透射电镜检查结果 fig 2 TEM photograph of poliovirus type 1 henan strain in infected Hep 2 cells 12000 3 3 讨论讨论 常用的 PV 提纯方法是丁醇抽提 酶处理及两次超速离心后 再经速率区带密度梯度离心 5 有较高的感染性回收率 但费时费力 不易操作 难以用于经常性提纯使用 而 PEG 沉淀 法适于从含有大量宿主蛋白和磷脂的大体积 通常为数千毫克升 原始材料中选择性沉淀病毒 具 有手段温和 非病毒蛋白残留量少等优点 但单独使用则感染性回收率低 本实验通过冻融 粉 碎 低速离心等预处理去除细胞碎片而降低沉淀过程中非病毒蛋白的影响 结果显示约 25 的细 胞蛋白被沉淀去除 在此基础上 用 PEG 6000 沉淀法结合差速离心 可去除 99 以上的非病毒蛋 白 感染性回收率为 29 0 提纯系数 PF 168 与单独 PEG 沉淀 PF 为 66 4 6 相比提高了近 一倍 与蔗糖密度梯度离心相比 虽然感染性回收不及前者 47 0 7 但相对而言 方法简 便易行 适合于水中 PV 消毒实验人工病毒污染水样的经常性制备 作者简介 作者简介 张文清 1965 男 汉族 安徽省怀宁县人 讲师 博士 现工作在第一军医大 学军队卫生学教研室 广州 510525 Tel 020 7705370 48522 Email defaultuser 张文清 第四军医大学 预防医学系军队卫生学教研室 陕西西安 710033 马文煜 第四军医大学 基础部微生物学教研室 陕西 西安 710033 骆文静 第四军医大学 预防医学系军队卫生学教研室 陕西西安 710033 姜绍谆 第四军医大学 基础部微生物学教研室 陕西 西安 710033 胡艳冰 第四军医大学 预防医学系军队卫生学教研室 陕西西安 710033 侯悦 第四军医大学 预防医学系军队卫生学教研室 陕西西安 710033 张进 第四军医大学 预防医学系军队卫生学教研室 陕西西安 710033 于碧云 第四军医大学 基础部微生物学教研室 陕西 西安 710033 参考文献参考文献 1 韩 友 消毒剂灭活病毒影响因素的研究进展 J 中国消毒学杂志 1993 10 3 168 171 2 Emerson MA Sproul OJ Buck CE Ozone inactivation of cell associated virus J Appl Environ Microbiol 1982 43 2 603 610 3 张文清 姜绍谆 马文煜 et al 水中脊髓灰质炎病毒细胞感染模型中病毒株与细胞株 的筛选 J 第四军医大学学报 1998 19 6 643 645 4 张文清 姜绍谆 马文煜 et al 水中脊髓灰质炎病毒感染性 抗原