简便快速的PCR技术.ppt

简便快速的PCR技术 依赖核酸序列的扩增技术 NucleicAcidSequence BasedAmplification NASBA 反应体系 缓冲溶液AMV逆转录酶T7RNA聚合酶RNaseH引物 下游引物5 端带有T7RNA聚合酶启动子序列 依赖核酸序列的扩增技术 NucleicAcidSequence BasedAmplification NASBA 原理 靶RNA经AMV逆转录 形成RNA DNA杂交体RNaseH降解杂交体的RNA 剩下单链DNAAMV以其为模板 合成含T7RNA聚合酶启动子的双链DNAT7RNA聚合酶以其不断转录出靶RNA进入新一轮扩增循环产物主要为反义单链RNA RNA DNA杂交体和双链DNA 依赖核酸序列的扩增技术 NucleicAcidSequence BasedAmplification NASBA 特点 可直接扩增特异性单链RNA整个反应不需PCR仪 无需温度循环 没有高温变性步骤 不会受到外来双链DNA的污染 反应速度快 忠实性好 特异性强 敏感性高 加入变性步骤 也能扩增双链DNA 环介导等温扩增技术 loop一mediatedisothermalamplification LAMP 反应体系 缓冲液具有链置换特性的DNA聚合酶dNTP模板DNA能够识别靶DNA6个特异序列的4条引物 引物为2条内引物和2条外引物 环介导等温扩增技术 loop一mediatedisothermalamplification LAMP 哑铃状模板合成阶段 引物FIP首先和F2c结合启动互补链的合成 形成双链结构 图1b F3再和F3c结合 启动链置换反应 释放出1条FIP连接的互补链 在其一端能够形成环状结构 图1d 这条单链DNA 又可作为模板 在另一端分别结合BIP和B3 合成1条双链 并置换出1条哑铃状的DNA 图1f 哑铃结构很快与其一端F1c和F1互补 而由自我引物延伸机制合成1种双链的茎环结构DNA 图1g 这种茎环结构的双链DNA是循环反应的原料 循环反应阶段 FIP和双链茎环结构DNA 图Ig 中的环状结构结合 形成1种有缺口的过渡性茎环结构DNA 该结构在茎上含有靶序列的1个额外反向复制序列 在对面的末端 通过BIP形成1个环状结构 在随后的自我引物置换延伸合成过程中 在内引物作用下 开始循环反应 茎的长度和环的个数都逐渐增加 最后的产物为茎环DNA组成的混合物 即含有若干倍茎长度茎环结构和类似花椰菜的结构 含有在同一链上由退火形成的 在靶序列的交替反向重复序列之间的多重环状结构 环介导等温扩增技术 loop一mediatedisothermalamplification LAMP 扩增结果判定 有3种判定方法1 琼脂糖电泳后 用EB或SYBRGreenI染色检测 2 产物中加入Mg 试剂 肉眼观测副产物焦磷酸镁沉淀 阳性 液体浑浊 静置有白色沉淀 3 产物中加SYBRGreen 肉眼观察颜色反应 绿色阳性 橙红色阴性 优点 灵敏度高能检测到比PCR低10倍的拷贝数 用3一5个细胞样本就可进行动物胚胎性别鉴定 特异性强LAMP引物需与靶序列上的6个特异部位准确结合 因此能获得比PCR更高的特异性 速度快LAMP是恒温扩增反应 没有PCR反应中温度变化的耗时 在30 60min内即可完成反应过程 另外 增加环引物还可缩短时间 大大提高了检测的效率 设备简单LAMP反应只