酵母三杂交应用及研究进展

1 酵母三杂交系统研究进展酵母三杂交系统研究进展 许多生物过程是通过大分子如蛋白 蛋白 核酸 蛋白的相互作用来实现的 对这些大 分子间的相互作用的研究有助于揭示生命过程的分子作用机制 酵母双杂交系统是研究蛋 白间相互作用的有用工具 随着该系统的广泛应用 在此基础上发展了三杂交系统 研究 包括三种成分在内的更为复杂的大分子相互作用 为蛋白 蛋白 RNA 蛋白和小分子 蛋白 相互作用的研究提供了新的手段 1 酵母三杂交系统的原理酵母三杂交系统的原理 与酵母双杂交系统相同 三杂交系统也是利用转录激活子调控真核基因转录的特点 许多转录激活子由结构上可分而功能上独立的两个结构域组成 如酵母 Gal4 转录激活子包 括 DNA 结合域 DNA binding domain DNA BD 和转录激活域 activation domain AD 将 DNA BD 与诱饵蛋白 X 融合 AD 与靶蛋白 Y 融合 分别构建 BD X 和 AD Y 重组质粒 载体 并在酵母细胞中共表达 如果诱饵蛋白 X 与靶蛋白 Y 相互作用 DNA BD 和 AD 相 互靠近 重组成有活性的 Gal4 转录激活子 DNA BD 与上游激活序列 UAS 结合 而 AD 则激活下游报告基因 如 lacZ 或 HIS3 的转录 通过检测 半乳糖苷酶活性可确定 LacZ 基因的表达水平 此外 HIS3 编码咪唑甘油磷酸脱氢酶 His3p 能使酵母在组氨 酸缺陷培养基上生长 3 氨基 1 2 4 三唑 3 AT 是 His3p 的竞争性抑制剂 His3p 表达水 平高的细胞能在含有较高 3 AT 浓度的培养基上生长 因此 酵母细胞对 3 AT 的抑制水平 体现了蛋白 蛋白相互作用的强度 与酵母双杂交系统不同 三杂交是研究两个蛋 白和第三个成分间的相互作用 通过第三个分子使 两个杂合蛋白相互靠近 第三个成分不同 可以是 蛋白 RNA 或小分子 在以蛋白为基础的三杂交 系统中 蛋白 X 与 Y 的稳定相互作用依赖于蛋白 Z 的存在 Z 介导相互作用或诱导一个蛋白的构象 改变 如 X 从而促进与另一个蛋白 Y 的相互作 用 图 1 在以 RNA 为基础的三杂交系统中 DNA 结合域 LexA BD 或 Gal4 BD 与 RNA 结合 蛋白 如 MS2 外壳蛋白或 Hiv 1 RevM10 融合成 第一个杂合蛋白 转录激活域 Gal4 AD 与感兴 趣的 RNA 结合蛋白 Y 融合成第二个杂合蛋白 第 三个杂合 RNA 分子包含与第一个 RNA 结合蛋白 MS2 或 RRE 结合的位点 RNA 以及与 RNA 结合蛋白 Y 结合 图 1 蛋白三杂 交系统 的位点 X 蛋白 Y 与 RNA 结合位点 X 结合形成具 Fig 1 protein dependent three hybrid system 功能的转录激活子 图 2 在小分子三杂交系统中 第三个杂合分子为异源二聚化的小分 子复合物 如 Dex FK506 DeX Mtx 使 BD X 与 AD Y 融合蛋白相互靠近 重新组成具 有功能的转录激活子 图 3 在 SenGupta 等 1 最早提出的三杂交系统中 第一个杂合蛋 白 LexABD MS2 由酵母的 L 40 膜蛋白编码 第二个杂合蛋白 Gal4AD Y 由质粒表达 杂 合 RNA 分子由 RNA 聚合酶 产生 包括 RNAse P 5 前导序列和 3 尾随序列 位于 mRNA 终止密 码子后 RNA 聚合酶 含有一段由 4 个或多个 T 残基形成的转录终止子 而许多 RNA 结合蛋白识别富含 U 的 RNA 靶标 不能被 RNA 聚合酶 转录 Putz 等 2 利用 RNA 聚合 2 酶 转录 RNA 杂合分子 从而避免富含 U 的靶 RNAs 成熟前的转录终止 图 2 RNA 介导的三杂交系统 图 3 小分子三杂交系统 Fig 2 RNA dependent three hybrid system Fig 3 Small molecule three hybrid system 2 酵母三杂交系统的应用酵母三杂交系统的应用 2 1 研究蛋白研究蛋白 蛋白之间的相互作用蛋白之间的相互作用 酵母双杂交系统是检测蛋白 蛋白相互作用的强有力工具 但仅限于研究两个蛋白之间 为了适用于分析三蛋白复合物 Zhang和Lautar 3 发展了三杂交系统 并利用该系统检验了 Grb2介导的表皮生长因子 EGF 受体与Sos蛋白 一种鸟嘌呤核苷酸交换因子 的相互作 用 Tirode等 4 对三杂交系统进行了改进 将带有Met25启动子的第三个蛋白的基因克隆到 已经编码Gal4或LexA融合蛋白的质粒上 Met25是条件型启动子 在缺乏Met的培养基中就 可诱导第三个蛋白的表达 这样 就可以利用两个重组载体研究三个蛋白之间的相互作用 在一些情况下 诱饵蛋白在与目的蛋白结合前要经过翻译后修饰作用 而双杂交的局限性 之一就是在酵母中缺乏一些重要的翻译后修饰作用 如酪氨酸磷酸化 Osborne 等 5 利 用三杂交系统研究了高亲和性IgE受体 亚基Fc RI 通过构建重组质粒 向双杂交系统中 引入酪氨酸激酶Lck 使SH2结构域磷酸化 从而诱导SH2的构象改变 与Fc RI 发生相互 作用 利用三杂交系统还可以从cDNA文库中筛选编码桥蛋白的克隆 以Gal4 BD EGF受体融 合蛋白和Gal4 AD Sos融合蛋白作为诱饵 从cDNA文库中筛选出编码Grb2的蛋白 3 利用 三杂交系统从cDNA文库中筛选出的片段编码的蛋白可能是修饰两个蛋白相互作用的调节 蛋白 而从合成文库中筛选到的肽可以作为破坏两个蛋白相互作用的抑制剂 为设计干预 病理途径的药物提供了信息 2 2 研究研究 RNA 与蛋白之间的相互作用与蛋白之间的相互作用 酵母三杂交系统可用于检测 RNA 蛋白的相互作用 如铁离子调节蛋白 IRP 与铁效 应元件 IRE HIV 反式激活蛋白 Tat 与 HIV 反式激活效应元件 TAR RNA 序列之 间的相互作用 1 利用三杂交系统还可以筛选相互作用蛋白 利用未知蛋白的靶 RNA 作诱 饵筛选 cDNA 文库 已成功地筛选出大约编码 20 种蛋白的 cDNA 片段 将表达杂合 RNA 3 的 DNA 序列克隆到载体上 与 BD MS2 一起转入酵母细胞 从 AD cDNA 文库中筛选出 与性别分化有关的秀丽隐杆线虫 Caenorhabditis elegans fem 3 mRNA 结合因子 6 利用 细胞或病毒 mRNA 的 5 或 3 UTR 为诱饵筛选出的蛋白 通过影响 mRNA 代谢如 5 和 3 的 加工 核质穿梭 翻译和稳定性等过程来参与蛋白表达的调节 如从 cDNA 文库中筛选出 的编码两个蛋白 CUG BP 和 XB1 的 cDNA 在拼接过程中与内含子结合 利用三杂交系统 除了能筛选出预期的相互作用蛋白外 还能筛选出未知的蛋白 从而加深我们对 RNA 结 合蛋白功能的认识 用人端粒酶 RNA 进行三杂交 筛选出 hStau 蛋白和一个意想不到的核 糖体蛋白 L22 7 以波形蛋白 vimentin 3 UTR 为诱饵 筛选出 HAX 1 和 EF1 两个蛋 白 EF1 参与了与细胞周期有关的波形蛋白 mRNA 的翻译 而 HAX 1 对于波形蛋白在 细胞外周的定位是必需的 8 可见 HAX 1 和 EF1 参与了波形蛋白代谢的两个不同过程 为了鉴定 RNP 复合物的蛋白组分 Sonoda 等 9 对酵母三杂交系统进行了修改 将感兴趣的 蛋白与其靶 RNA 的复合物与 LexA BD 融合 从 cDNA 文库中筛选新的 RNP 结合蛋白 利用 Pumilio hunchback mRNA NRE 片段 复合物筛选出 nanos 蛋白 然后用三元复合物 Pumilio NRE nanos 作诱饵筛选 Brat 蛋白 这是迄今为止包括三个蛋白和一个 RNA 分子相 互作用的酵母四杂交的最早报道 利用酵母三杂交系统 以一个蛋白作诱饵还能筛选出与之结合的 RNA 分子 利用酵 母蛋白 Snp1 筛选出与之相互作用的同源的 U1 snRNA 10 用鼠 hnRNP K 筛选人 RNA 文库 在筛选到的克隆中有很大一部分编码线粒体基因组 11 表明 hnRNP K 可能参与了线粒体基 因的表达 这是以前无法预料的 RNA 或蛋白的突变体对鉴定生物学相关性是非常有用的 通过 RNA 或蛋白的部分删 除 突变可以确定相互作用的最小结合域 Jaeger 等利用该策略研究组氨酸发夹结合蛋白 HBP 又称 SLBP 与组氨酸 mRNA 3 UTR 发夹的结合位点 从 pACT HBP 随机突变文 库中筛选出 5 个不能与野生型组氨酸发夹结合的单突变体 这些突变均位于 RNA 结合域 RBD 内 此外 利用酵母三杂交系统筛选能恢复与组氨酸发夹结合的基因内突变 发 现大多数回复突变定位在 RBD 外 这表明 RBD 内的几个残基与 RBD 两侧的区域之间可 能存在内部相互作用 12 2 3 研究小分子研究小分子 蛋白相互作用蛋白相互作用 小分子和受体的相互作用调节着许多基本的细胞过程 合成的小分子广泛用于基础生 物学研究 是利用药物进行疾病治疗的基础 传统的体外检测小分子结合蛋白的方法主要 通过亲和层析 affinity chromatography 光交联 photocrosslinking 放射标记配体结合 radiolabelled ligand binding 等生物化学方法 从复杂的细胞抽提物中纯化蛋白 费时而 且费力 小分子三杂交系统 Small molecule three hybrid 是在双杂交的基础上引入一个小 分子异源二聚体 提供了一种简单易行的快速检测体内小分子 蛋白相互作用的方法 小分子三杂交系统最初起源于利用具有细胞通透性的二聚化小分子化学诱导剂 chemical inducers of dimeration CIDs 来促进哺乳动物细胞嵌合受体的寡聚化 13 小分 子配体通过促进与其结合的融合蛋白之间的寡聚化来控制许多与细胞凋亡或增殖有关的信 号转导途径 CIDs 作为具有潜在基因治疗作用的候选药物 正成为病理学研究的热点 以 小分子为基础的三杂交系统可用于鉴定与特异配体相互作用的蛋白 由于地塞米松 Dex 和 FK506 能分别与糖皮质激素受体 GR 和 FKBP12 结合 均能透过酵母细胞 具有被修饰而不破坏受体结合的化学特性 将 GR 与 LexA BD 融合 而 FKBP12 与 AD 融 合 在添加含 Dex FK506 异源二聚体的培养基中 小分子异源二聚体 Dex FK506 能使 LexA BD GR 和 FKBP12 AD 二聚化 从而激活报告基因的表达 14 利用 Dex FK506 成 功的从 Jurkat 细胞的 cDNA 文库中筛选出编码 FKBP 的 cDNAs Lin 等 15 发展了 Dex 氨 甲蝶呤 MTX 酵母三杂交系统 将 LexA BD 与二氢叶酸还原酶 DHFR 融合 糖皮质 4 激素受体 GR 与 AD 融合 利用化学合成的异源二聚体 Dex 氨甲蝶呤 MTX 诱导 LexA BD DHFR 和 AD GR 二聚化 从而激活报告基因的转录 Henthorn 等将 Gal4 转录激 活子用于小分子三杂交系统 可以从大量的来自不同的生物体和特定哺乳动物组织的 Gal4 AD 文库中筛选蛋白 他们利用该系统筛选鼠 cDNA 文库 从 5 106个克隆中筛选出 4 个 MTX 结合蛋白 2 个已知的和 3 个新的 GR 相互作用蛋白 16 此外 将逆向双杂交系统与 小分子配体筛选技术相结合可用于筛选破坏蛋白相互作用的小分子抑制剂 17 利用与小分 子三杂交类似的系统筛选新的 CIDs 这些都是进行病理学研究的有用工具 3 酵母三杂交系统的优点及局限性酵母三杂交系统的优点及局限性 酵母三杂交提供了一种简单快速检测体内蛋白 蛋白 RNA 蛋白 小分子 蛋白相互作 用的方法 由于是在体内进行 蛋白有可能保持其天然构象 此外 它还是检测弱相互作 用和瞬时相互作用的敏感方法 与许多体外检测法不同 三杂交系统不需要纯化靶蛋白和 抗体 三杂交系统也具有其局限性 许多重要的蛋白质不在核内 当杂合蛋白超表达时会产 生毒性 由于错误折叠或缺乏翻译后修饰而不具功能 具有完整功能的核蛋白由于本身是 转录激活剂或抑制剂而被排斥在双杂交之外 核内加工机制可能会导致杂合 RNA 的截短 一些 RNA 含有细胞器的靶向定位信号 不能激活核内的报告基因 插入 RNA 的长度也是 决定三杂交活性的一个重要因素 在重组实验中 RNA 序列的长度一般应小于 150 nt 如 TAR IRE 才能激活报告基因的表达 在小分子三杂交系统中 杂合小分子需要扩 散进酵母细胞核 渗透性问题也会限制它的应用 此外 由于三杂交系统是在体内检测蛋白 蛋白 RNA 蛋白 小分子 蛋白的相互作用 会受到许多细胞参数的影响 导致假阳性克隆增多 给筛选带来困难 而 SELEX 噬菌斑 测定和 T7 噬菌体展示技术由于能在体外筛选相互作用蛋白 因此可控性较强 4 酵母三杂交系统的发展与展望酵母三杂交系统的发展与展望 酵母三杂交系统具有比双杂交更广阔的应用范围 不仅用于研究蛋白 蛋白之间的相互 作用 还为研究 RNA 蛋白 小分子药物 蛋白的相互作用研究提供了新的手段 酵母三杂 交的研究已经扩展到分析三个或多个蛋白复合物 如筛选 RNP 复合物中的诱饵结合蛋白 预示着它可能在更复杂情况下得到应用 但由于三杂交结果只是反映酵母细胞内的蛋白 蛋 白 RNA 蛋白 小分子 蛋白之间相互作用的可能性 为避免出现假阳性 还必须经过其 它的试验 如光交联 放射配体结合 免疫共沉淀等 加以验证 随着序列数据库和基因组信息的增加 将酵母三杂交与大规模筛选技术相结合 可以 为建立贯穿整个基因组的蛋白 蛋白 RNA 蛋白之间的相互作用图谱奠定基础 5 参考文献参考文献 1 SenGupta DJ Zhang B Kraemer B et al A three hybrid system to detect RNA protein interactions in vivo Proc Natl Acad Sci USA 1996 93 8496 501 2 Putz U Skehel P and Kuhl D A tri hybrid system for the analysis and detection of RNA protein interactions Nucleic Acids Res 1996 24 23 4838 40 3 Zhang J and Lautar S A yeast three hybrid method to clone ternary protein complex components Analytical Biochemistry 1996 242 1 68 72 4 Tirode F Malaguti C Romero F et al A conditionally expressed third partner stabilizes or prevents the formation of a transcriptional activator in a three hybrid system J Biol Chem 5 1997 272 22995 9 5 Osborne MA Dalton D and Kochan JP The yeast tri hybrid system genetic detection of tansphosphorylated ITAM SH2 interactions Biotechnology 1995 13 1474 8 6 Zhang B Gallegos M Puoti A et al A conserved RNA binding protein that regulates sexual fates in the C elegans hermaphrodite germ line Nature 1997 390 477 84 7 Le S Sternglaz R and Greider CW Identification of two RNA binding proteins associated with human telomerase RNA Mol Biol Cell 2000 11 3 999 1010 8 Al Maghrebi M Bruel H Padkina M et al The 3 untranslated region of human vimentin mRNA interacts with protein complexes containing eEF 1gamma and HAX 1 Nucleic Acids Res 2002 30 23 5017 28 9 Sonoda J and Wharton RP Drosophila Brain Tumor is a translational repressor Genes Dev 2001 15 6 762 73 10 SenGupta DJ Wickens M and Fields S Identification of RNAs that bind to a specific protein using the yeast three hybrid system RNA 1999 5 596 601 11 Ostrowski J Wyrwicz L Rychlewski L et al Heterogeneous nuclear ribonucleoprotein K protein associates with multiple mitochondrial transcripts within the organelle J Biol Chem 2002 277 8 6303 10 12 Jaeger S Eriani G and Martin F Critical residues for RNA discrimination of the histone hairpin binding protein HBP investigated by